结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌免疫学特性

　　　　 作者：柏银兰， 薛莹， 王丽梅， 樊爱琳， 张薇， 何俊杰， 康健， 徐志凯

【摘要】 　　目的: 研究结核分枝杆菌MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫学特性。方法: 用分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌疫苗免疫BALB/c小鼠， ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度和抗体亚类。分离免疫小鼠脾淋巴细胞， 检测淋巴细胞增殖、IFNγ和IL12产生水平、CD4+细胞和CD8+细胞数、脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应。毒株攻击后对脾脏细菌负荷计数。结果: MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗免疫可诱导小鼠高水平的体液免疫应答， 免疫小鼠脾淋巴增殖明显， IFNγ和IL12含量增加， CD4+和CD8+细胞百分比明显增加， CTL杀伤效应明显， 对MTB H37Rv攻击后有一定的保护作用。结论: MPT64重组母牛分枝杆菌疫苗可诱导小鼠有效的体液和细胞免疫应答， 有可能作为新型TB疫苗候选。

【关键词】 结核分枝杆菌; 母牛分枝杆菌; 疫苗; MPT64

　　［Abstract］AIM: To evaluate immunoprophylaxis of recombinant Mycobacterium vaccae secreted MPT64 of Mycobacterium tuberculosis. METHODS: BALB/c mice were immunized with recombinant Mycobacterium vaccae secreted MPT64 of Mycobacterium tuberculosis. ELISA was used to detect the antiMPT64 antibody titers and subtype in immunized mice sera. Splenocytes of immunized mice were separated and used to detect IFNγ and IL12 levels， splenocytic proliferation， counts of CD4+ and CD8+ T cell percentage， cytolytic T lymphocyte specific lysis. The bacteria numbers in vaccination animal's lung and spleen were counted by colony forming units （CFUs）on plate. RESULTS:　　Recombinant Mycobacterium vaccae secreted MPT64 of Mycobacterium tuberculosis could induce high level of specific IgG antibodies， stronger T cell proliferation response， production of IFNγ and IL12， CD4＋ and CD8＋ cell percentages and CTL effect in mice. And an efficacy protection against Mycobacterium tuberculosis was also observed in mice model. CONCLUSION: Recombinant Mycobacterium vaccae secreted MPT64 could induce high level humoral and cell mediated immune responses in mice and could be used as a candidate of new vaccine against TB.
　　
　　［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium vaccae; vaccine; MPT64

　　非致病性分枝杆菌在生物种系上与结核病（Tuberculosis， TB）的病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）具有高度近源关系， 诸多生物学性状与后者相似， 最能模拟MTB感染的自然过程， 且其对人类致病性低或不致病， 故其极具成为抗TB疫苗的潜力。母牛分枝杆菌（Mycobacterium vaccae， MV）就是其中一种， 它的生长速率比MTB快10倍， 将MTB分泌型蛋白的基因转入后， 在克隆基因本身的启动子作用下能稳定地表达重组分泌型蛋白［1］。MPT64是存在于MTB早期培养滤液中的一种主要分泌蛋白， 具有较强的细胞免疫活性， 还能诱发豚鼠发生迟发型超敏反应（delayedtype hypersensitivity， DTH）， 因此， MPT64在TB疫苗和诊断试剂方面表现出来的应用潜能引起研究者强烈的兴趣［2］。我们在前期工作中［3］成功构建了分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌（recombinant Mycobacterium vaccae， rMV）， 进一步研究其免疫学特性， 以期为后续的疫苗研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　分泌表达MPT64的重组母牛分枝杆菌菌株rMVMPT64由本室构建［3］。羊抗鼠IgG2a、羊抗鼠IgG1购自SouthernBiotech公司; 小鼠CD4/CD8双标记mAb购自Serotech公司; TRIzol、RNA 酶抑制剂、CTL检测试剂盒、MTT检测试剂盒均购自Promega公司; P815细胞（小鼠肥大瘤细胞， h3d）本室保存。BALB/c小鼠（雌性， 6～8周龄， 18～20 g/只）， 由第四军医大学实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物免疫及分组

　　用rMVMPT64和MV免疫小鼠， 每只剂量为105 CFU/0.1 mL， 于背部皮下多点接种， 3周后加强1次。阳性对照组小鼠皮下接种BCG 105 CFU/0.1 mL。阴性对照组注射生理盐水0.1 mL/只。免疫结束后4周， 每组取5只小鼠用于测定淋巴细胞增殖指数、细胞因子水平、CD4+/CD8+细胞计数及CTL效应。另外5只小鼠用于MTB H37Rv攻击保护实验。

　　1.2.2 免疫小鼠抗体水平检测方法

　　以重组MPT64蛋白作为包被抗原， ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。抗体亚类检测: 包被同上， 二抗分别加入1∶4 000稀释的HRP标记羊抗鼠IgG1和IgG2a抗体100 μL/孔， 37℃孵育1 h; 洗涤后加入底物（OPD）溶液显色， 再加入终止液， 测定A490值。以正常小鼠血清作阴性对照， P/N≥2.1为阳性。

　　1.2.3 抗原特异的脾淋巴细胞增殖实验

　　用含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液将分离的淋巴细胞浓度调整至5×108/L， 加入96孔板中， 200μL/孔， 同时实验组每孔加入5mg/L重组MPT64蛋白50μL， 对照组不加蛋白， 调零孔不加脾细胞， 置50 mL/L CO2孵箱中37℃培养72 h后， 每孔加20μLMTT， 继续培养4 h后终止培养， 弃上清， 加100 g/L SDS 25μL/孔混匀， 测定A490值。每组细胞均设PBS阴性对照， 且均为复孔。结果用刺激指数SI=实验组A值/对照组A值表示。

　　1.2.4 细胞因子IFNγ和IL12测定

　　用含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液将各组免疫小鼠脾细胞调整至5×109/L， 加入24孔板中培养， 800μL/孔， 分别加入5 mg/L重组MPT64蛋白200μL/孔， 每组细胞均设PBS阴性对照， 且均为复孔。置50 mL/L CO2孵箱中37℃ 72 h， 收集培养液， 5000 r/min离心5min， 取上清， -20℃冻存备检。参照试剂盒（夹心ELISA法）说明书进行， 测定上清依次加入生物素化抗小鼠细胞因子抗体、HRP标记的亲和素， 显色后测定A450值， 并利用绘制的标准曲线计算各样品中所含IFNγ和IL12浓度。

　　1.2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞CD4＋/CD8＋细胞计数

　　免疫小鼠摘眼球采血， 分离外周学淋巴细胞。用100 mL/L FCS RPMI 1640制成单细胞悬液， 每份取100 μL， 加入荧光标记的CD4/CD8 mAb充分混匀， 室温避光染色30 min。1 000 r/min离心5 min， 洗涤液洗涤2次， 弃上清， 加入终浓度20 g/L的多聚甲醛固定液500 μL重悬细胞， 流式细胞仪检测。

　　1.2.6 免疫小鼠CTL活性检测

　　CTL检测采用乳酸脱氢酶（LDH）方法。确定表达MPT64的P815细胞（靶细胞）的最佳细胞数。靶细胞和效应细胞数量分别按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50混匀加入96孔板试验组中， 250 r/min， 离心4 min后37℃孵育4 h， 离心前45 min加入10×裂解液至靶细胞最大LDH释放量组， 每孔吸取50 μL上清转移至新96孔板， 加入50 μL底物混合液， 室温避光反应30 min， 加入50 μL终止液， 检测A490值。CTL杀伤率=［（试验组-效应细胞自发LDH释放量-靶细胞自发LDH）/（靶细胞最大LDH释放量-靶细胞自发LDH释放量）］×100%。

　　1.2.7 MTB H37Rv株的攻击实验

　　各组小鼠最后1次免疫完成后4周， 用MTB H37Rv毒株经尾静脉感染， 剂量为106 CFU/只， 6周后， 断颈处死小鼠， 无菌条件下进行脾脏匀浆， 倍比稀释后铺改良罗氏培养基平板， 37℃孵箱培养3～4周， 计数细菌CFU。

　　2 结果

　　2.1 免疫小鼠血清特异性抗体的滴度及亚类

　　ELISA法检测各组免疫小鼠血清中特异性抗体的结果表明， rMVMPT64免疫2周后就可检测到抗体， 加强免疫后抗体升高， 最高可达1∶6 400， 与BCG免疫组水平相当， 生理盐水对照组为阴性。对抗体亚类分析表明， rMVMPT64免疫组产生IgG2a/IgG1比例显著增加， 为2.1（P&<0.01）， 超过MV免疫组， 而低于BCG免疫组（图1）。

　　2.2 抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖

　　测定各组免疫小鼠的脾脏淋巴细胞增殖反应的结果表明， 用CFP抗原刺激后， 与生理盐水对照组比， rMVMPT64和MV免疫组脾淋巴细胞在抗原刺激下增殖显著（P&<0.01）， 低于BCG免疫组的3.56， 而显著高于MV免疫组的1.67（P&<0.01， 图2）。

　　2.3 免疫鼠脾淋巴细胞诱生细胞因子水平

　　rMVMPT64免疫小鼠脾淋巴细胞悬液在体外用抗原刺激后， IFNγ含量显著增加， 为(978.11±11.37) ng/L， 超过MV组（780.12±11.81) ng/L和生理盐水对照组（80.44±11.53) ng/L， 而低于BCG免疫组（1242.17±32.11) ng/L（图3）。IL12含量显著增加， 为(498.27±17.43) ng/L， BCG免疫组为(632.17±32.11) ng/L， 而MV组为(410.43±18.29) ng/L， 生理盐水对照组为(54.76±19.55) ng/L（图4）。rMVMPT64免疫组的IFNγ和IL12诱生比MV免疫组高（P&<0.01）， 而与BCG相比有一定差距（P&<0.05）。

　　2.4 外周血淋巴细胞CD4＋/CD8＋细胞流式细胞术检测

　　分离各组免疫小鼠的脾淋巴细胞， 流式细胞仪计CD4＋细胞和CD8＋细胞数。与生理盐水对照组比， rMVMPT64免疫组CD4＋细胞和CD8＋细胞数及CD4＋细胞/CD8＋细胞比值明显增加（P&<0.01）; 与MV免疫组比较CD4＋细胞/CD8＋细胞比值显著提高（P&<0.01）; CD4＋细胞和CD8＋细胞百分比与BCG免疫组相似， 但是CD4＋细胞/CD8＋细胞比值明显增加（P&<0.01， 表1）。表1 流式细胞术检测免疫小鼠脾淋巴细胞CD4+细胞/CD8+细胞（略）
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　　2.5 脾淋巴细胞特异性CTL杀伤效应

　　用LDH方法检测CTL活性的结果表明， 在效应细胞与靶细胞比值为1∶50时， rMVMPT64免疫组为33%， MV免疫组为20%， 生理盐水组为7%。rMVMPT64免疫组CTL杀伤效应显著提高（P&<0.01， 图5）。

　　2.6 MTB H37Rv株攻击保护实验

　　MTB H37Rv株攻击各组免疫小鼠4周后， 取菌分离脾脏和肺脏， 计数荷菌CFU。与生理盐水对照组相比较， rMVMPT64免疫对MTB在体内的增殖有显著抵抗作用（P&<0.01）; 高于MV免疫组（P&<0.01）， 低于BCG免疫组（P&<0.01， 表2）。表2 免疫小鼠MTB毒株攻击后的脾脏细菌负荷（略）

　　3 讨论

　　重组活疫苗是目前研究较多的TB疫苗， 它是将编码MTB保护性抗原的基因导入活的微生物载体构成的， 是TB新型疫苗研制的重要方向之一［4］。研究表明， MTB毒力因子通常也是引起机体强烈免疫应答的特异性抗原， 而且是MTB逃避机体免疫系统杀伤的重要机制， 非致病性MTB缺失这些优势抗原， 这也是其引发的免疫反应不如MTB的原因之一［5］。在本研究中， MV免疫能引起小鼠一定的体液和细胞免疫反应， 免疫学检测指标表明， 总体效价不高。

　　MV主要通过影响Th1型和Th3型细胞免疫应答的力量对比来抗MTB感染［6］， 这一点可用于治疗性疫苗， 调节已感染机体的免疫状态， 而MV用于预防未发生的感染， 需要提高其免疫原性及免疫力的持续性。在本研究中， 一方面通过在MV中分泌表达免疫优势蛋白MPT64来提高MV的免疫原性; 另一方面， 在免疫策略上， 与BCG只免疫1次的做法不同， 采取了加强免疫的方法， 以期获得持久免疫力。MTB H37Rv株mpt64基因共687 bp， 天然MPT64是一个相对分子质量约23 000的分泌蛋白， 具有超氧化物歧化酶活性， 在结核杆菌培养早期分泌到滤液中， 占分泌蛋白总量的8％。大肠杆菌表达的重组MPT64蛋白可使TB患者IFNγ释放量明显高于BCG免疫者， 在TB感染动物体内还可引发迟发性超敏反应（DTH）， 而BCG或环境分枝杆菌致敏者无反应， MPT64不仅是抗结核免疫的靶抗原， 而且也是结核杆菌感染记忆免疫应答的主要抗原［7］。

　　我们通过分泌表达MTB优势抗原MPT64 的重组MV的接种， 比较了重组MV疫苗和MV的免疫保护力。研究表明， 重组MV疫苗免疫显著提高了MV的免疫保护力。重组MV免疫组特异性抗体水平明显提高， 脾淋巴细胞增殖显著， Th1型细胞因子分泌增加。重组MV疫苗组的CD4+细胞和CD8+细胞总数与BCG免疫组相似， 而CD4+细胞和CD8+细胞比值均大大超过BCG免疫组， 这可能与MV对Th1型和Th3型细胞免疫应答调节机制有关［6］。虽然重组MV未达到BCG保护水平， 但其可诱导高水平的体液和细胞免疫应答水平， 特别是CD8+T活性增加， 有助于MTB从体内清除。因此， 重组MV有可能作为新型TB疫苗的候选组分。
　　
　　重组MV作为一种活的微生物， 进入机体后有可能造成病理损伤。在本研究中， 重组MV免疫后， 小鼠没有出现体重减轻、发热等感染相应症状， 且心、肝、脾、肺等脏器肉眼观察无病理改变。虽然MV经培养及生物处理后冻干而制成的微卡苗已在我国研制成功， 并应用于临床［8］， 但其作为活疫苗的安全性仍需进一步观察。

参考文献

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