人脑胶质瘤组织中骨形成蛋白2的表达及其临床病理学意义

　　　　 作者：张明宇， 伍 军， 龚 欣， 陈若昆， 方加胜

【摘要】 目的: 探讨骨形成蛋白2（BMP2）在人脑胶质瘤中的表达和临床意义。方法: 随机选取脑胶质瘤患者88例， 采用SABC免疫组化方法和RTPCR技术， 检测脑胶质瘤组织和正常脑组织中BMP2蛋白及其mRNA的表达。并分析其与脑胶质瘤组织临床分级之间的关系。结果: BMP2蛋白在脑胶质瘤组织中的阳性表达率为78.40% (69/88)， 明显高于(P&<0.01)其在正常脑组织中的阳性表达率［3% (6/20)］。BMP2蛋白与mRNA 在脑胶质瘤高级别组(Ⅲ～Ⅳ级) 中的表达均明显高于低级别组(Ⅰ～Ⅱ级)， 说明随着肿瘤级别的升高BMP2表达也增强。结论: BMP2蛋白及其mRNA的异常表达可能与脑胶质瘤的恶性程度有关， 可以作为一个肿瘤标志物在临床中应用。

【关键词】 脑胶质瘤; 临床病理学; BMP2; mRNA

　　［Abstract］ AIM: To investigate the expression of BMP2 protein and mRNA in glioma， and evaluate its clinical significance in clinicopathological status of patients with glioma. METHODS: BMP2 protein and mRNA expression in 88 patients with glioma were examined by SABC immunohistochemistry and RTPCR， respectively. RESULTS: The positive expression rate of BMP2 protein in glioma tissues were 78.40% (69/88)， which was significantly higher (P&<0.01) than that in normal brain tissues ［3% (6/20)］. The expression of BMP2 protein and mRNA in gliomas of grade ⅢⅣ was also significantly higher than that in gliomas of grade ⅠⅡ. CONCLUSION: BMP2 expression in cancerous tissues may play an important role in the progression of glioma， which may help to predict patients’ prognosis as a tumor marker.

　　［Keywords］glioma; clinical pathology; BMP2; mRNA
骨形成蛋白（bone morphogenetic protein， BMP）属于转化生长因子β(TGFβ) 超家族成员， 分子结构为二聚体， 其中的亚单位由大约120个氨基酸构成［1］。BMP最初是作为一种可在异位诱导骨和软骨形成的蛋白质被发现， 后经研究证实其广泛分布于人体多种组织和细胞， 并对胚胎发生和发育、 组织与细胞的分化和增殖等方面起重要作用， 例如与牙、 大脑、 眼、 心脏、 肾、 肠、 肺、 皮肤、 骨和睾丸的发育有关［2］。此外， 近年来还有研究表明， BMP在不同的恶性肿瘤细胞中均有表达， 影响不同的恶性肿瘤细胞增殖和肿瘤形成， 具有调节肿瘤细胞生物学行为的作用。BMP2在该组蛋白中的功能和活性较强， 且对多种恶性肿瘤的生物学行为产生影响。2001 年， Jin等［3］选择9例正常上皮、 8例慢性炎症、 7例过度角化、 5例乳头状瘤、 29例鳞状细胞癌、 10例癌旁上皮和6 例硬腭黏膜上皮作为标本， 做免疫组织化学检测。结果显示BMP2在口腔黏膜的正常与良性病变上皮有弱表达， 而在具有高度恶变可能的癌旁上皮及癌变上皮中出现高表达。2006 年Feeley等［4］的体外实验证实BMP2可刺激溶骨性前列腺癌细胞系PC3的增殖、 迁移和侵袭能力， 此实验表明溶骨性前列腺癌病变中BMP 可以自分泌和旁分泌的形式刺激肿瘤的生长。还有研究发现， BMP2 mRNA 和蛋白在胰腺癌［5］、 乳腺癌［6］、 肺癌［7］等细胞中强表达。然而， 人们对于BMP2在人脑胶质瘤发生发展中的作用及其机制却知之甚少。为此， 我们应用免疫组织化学染色技术（SABC法）和逆转录聚合酶联反应（RTPCR）技术， 检测BMP2蛋白及其mRNA在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达， 探讨其与脑胶质瘤临床分级的关系。

1 对象和方法

　　1.1 对象 收集2005-07/2008-07经病理确诊为脑胶质瘤患者88例， 年龄40.9±2.6 (16～70)岁。患者术前均未行化放疗。对照组标本20例， 为非肿瘤组织中的正常脑组织。病理分级依照世界卫生组织(WHO) 2000 年关于颅内肿瘤的分类标准， 对每位患者肿瘤标本进行组织学级别评估， 分为Ⅰ级11 例， Ⅱ级20 例， Ⅲ级31 例， Ⅳ级26例。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组化SABC检测 采用免疫组织化学染色SABC法。标本依次进行以下处理: 多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 4 μm连续切片， 于70℃烤片15 min， 梯度乙醇脱水， 30 mL/L h3O2灭活内源酶， PBS 漂洗5 min×3次。正常山羊血清室温孵育15 min。滴加20～30　　 μL PBS 稀释的一抗4℃过夜。PBS 漂洗5 min×3次。二抗依次在37℃下， 孵育45 min， PBS漂洗5 min×3次。DAB显色5～10 min， 自来水充分洗涤， 苏木素复染5 min， 稀盐酸淡化30 s， 冲洗5 min。脱水、 透明、 封片， 镜检。设BMP2蛋白表达阳性的结肠癌组织为阳性对照， 用PBS替代第一抗体作阴性对照。鼠源性抗人BMP2 mAb（工作浓度1∶150）和免疫组织化学染色采用SABC法试剂盒均购自上海生工生物技术有限公司。BMP2蛋白表达阳性为细胞质出现棕黄色颗粒， 不出现者为阴性。在200倍光镜下观察10个视野， 每个视野计数100个细胞， 阳性细胞率小于30%为阴性， 阳性细胞率大于等于30%为阳性。

　　1.2.2 RTPCR 技术检测 TRIzol为Invitrogen公司产品， 按操作说明书步骤提取每例标本的总RNA后， 在扩增仪上进行RTPCR。根据紫外分光光度计测得各管总RNA质量浓度。当质量浓度在800～1 400 mg/L时， 各取4 μL总体积的RNA 逆转录成cDNA。逆转录条件: 加水至反应体系20 μL， 42℃ 1 h， 70℃变性10 min， 反应完毕后取出， 冰上放置5 min， 将生成的cDNA置于-20℃保存。分别取一定量的cDNA进行PCR扩增， 加引物1 μL， 模板1.2 μL， 其余按说明操作。PCR 条件: 94℃ 3 min， 94℃ 45 s ， 61℃退火45 s， 72℃延伸45 s; 扩增32个循环。

　　1.2.3 统计学分析 所有数据用SPSS13.0处理， 计数资料采用χ2检验。P&<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

　　2.1 BMP2蛋白的表达及其与脑胶质瘤临床分级的关系 免疫组织化学染色结果显示， 脑胶质瘤组织中， BMP2蛋白的阳性表达主要定位于癌细胞的细胞质， 呈弥漫分布的棕黄色颗粒， 强弱不等（图1）。BMP2蛋白的阳性表达率为明显高于其在正常脑组织中的阳性表达率［78% (69/88) vs 3% (6/20)， P&<0.01］。BMP2蛋白在脑胶质瘤组织中的表达情况与患者临床分级之间的关系见表1。经统计学分析可知， 高级别的脑胶质瘤组织中BMP2蛋白的阳性表达率明显高于低级别的脑胶质瘤组织(P&<0.05)。表1 BMP2蛋白表达与脑胶质瘤临床分级的关系

　　2.2 BMP2 mRNA的表达及其与脑胶质瘤临床分级的关系 脑胶质瘤组织中BMP2 mRNA的表达水平明显高于正常脑组织（0.48±0.22 vs 0.12±0.10， P&<0.01）。低级别组脑胶质瘤组织与高级别脑胶质瘤组织中， BMP2 mRNA水平具有统计学差异(0.33±0.16 vs 0.52±0.14， P&<0.05］。

　　3 讨论

　　脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤， 占原发性神经系统肿瘤的40%～60%［8］。胶质瘤的首选治疗方法仍是外科手术切除及辅助的放疗和化疗， 但手术只能做到肉眼全切除， 而不能做到病理学上的切除。无控性增殖和侵袭性生长是胶质瘤的恶性表型， 也是其临床治疗失败的根本原因［9］。因此， 从分子水平研究胶质瘤， 为临床提供可能的诊断和治疗靶基因显得尤为重要。

　　BMPs家族根据氨基酸序列的同源性可分为三组七类， 其中BMP2与BMP4因86%序列同源而归为一组［10］。现已证实， BMP2能够影响多种恶性肿瘤的细胞增殖和转移。其作用机制分为以下两类: （1）BMP2通过Smads途径和p38MAPK途径影响恶性肿瘤细胞的细胞信号传导［11］。Smads途径中， BMP2一方面可使恶性肿瘤细胞中Smad1/5被激活， 促使靶基因细胞分化抑制因子1的表达， 促进细胞增殖和肿瘤生长。但在无血清的培养基中， BMP2诱导活化的Smad1/5和表达的细胞分化抑制因子1明显减少， 并表现出细胞增殖和肿瘤生长抑制［12］。在动物实验中， 把BMP2和肺癌A549 细胞混合静脉注射， 可促进肺部肿瘤的生长， 并在肺部肿瘤中Smad1/5的活性和细胞分化抑制因子1的表达明显增强; 但BMP2和肺癌A549细胞混合注射在皮下形成的肿瘤中Smad1/5的活性和细胞分化抑制因子1的表达却下降。另一方面， 有学者证明BMP2激活了下游的信号传导通路的Smad1， 上调周期素依赖的激酶抑制剂p21CIP1/WAF1， 降低pRb蛋白的磷酸化， 而达到抑制肿瘤细胞的增殖［13］。Beck等［14］的实验发现在直肠癌细胞中， BMP2 使细胞核中的磷酸化的Smad1增加了2倍， 而当RAS/ERK被抑制时， 可额外增强2～3倍。BMP2增强BMP 特异的Smad 的转录活性比对照组高2倍， 并抑制细胞的增殖。但是RAS/ERK 的抑制进一步使BMP 特异的Smad 的转录活性增强1.5～2倍， 而使生长抑制作用增强20%。p38MAPK途径中， BMP2与细胞表面的I型受体结合形成复合体， 继而与II型受体结合形成异聚体BISC， II型受体通过桥蛋白、 再与TAKI间接连接， TAKI激活p38MAPK， 转导BMP的信号途径。（2）BMP2促进肿瘤血管的生成。BMP2刺激血管生成并不是简单的直接作用于细胞， 许多学者认为其与内皮细胞的活化有关， 即BMP2 通过信号转导活化内皮细胞来进一步发挥作用。虽然具体的信号转导通路学者们还有不同见解， 但倾向于BMP2通过磷酸化Smad1、 5、 8， ERK1、 2和增加Id1的表达来体现活化内皮细胞的能力。当然， 不排除诱导其他细胞因子的参与。例如， BMP2可在成骨细胞分化过程中， 通过血管内皮生长因子刺激新生血管的形成［15］。本研究中， 为揭示BMP2基因表达与脑胶质瘤临床分级的关系， 我们应用免疫组织化学染色方法和RTPCR方法检测BMP2蛋白和mRNA在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达， 证实BMP2基因在脑胶质瘤细胞中的表达显著高于正常脑组织。在高级别的脑胶质瘤组织中， BMP2的表达水平比低级别的脑胶质瘤组织明显升高。可见， BMP2基因在肿瘤晚期高表达， 随着肿瘤的发展， 表达逐渐增强。

　　综上所述， BMP2蛋白和mRNA高表达于脑胶质瘤组织， 肿瘤进展后期表达水平升高， 与肿瘤的临床分级有关。这些提示BMP2基因参与脑胶质瘤的发生、 发展， 可用于临床诊断， 具有重要的参考价值。

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