17β雌二醇对人B淋巴细胞系IM9细胞的调节作用

　　　　 作者：宋向凤， 牛治国， 郭继强， 黄青松

【摘要】 　　目的: 探讨17β雌二醇（17βestradiol， E2）在体外对人B淋巴细胞系IM9细胞的调节作用。方法: MTT法检测IM9细胞的增殖; RTPCR检测IM9细胞IgG及凋亡相关基因Bcl2、Bax的表达; 流式细胞术（FCM）检测IM9细胞凋亡情况。结果: 10-6～10-4 mol/L浓度的 E2对IM9细胞增殖有明显的抑制作用， 呈现剂量依赖性， 并抑制IM9细胞免疫球蛋白IgG的分泌， FCM显示E2诱导IM9细胞凋亡， Bcl2表达降低而Bax表达增强。结论: 不同浓度的E2可通过调节Bcl2、Bax基因表达及Bcl2/Bax表达比调节B淋巴细胞增殖及其免疫球蛋白的分泌。

【关键词】 雌激素; B淋巴细胞; IM9细胞; 调节

　　早在100多年前， 临床观察就已经认识到自身免疫病发病率存在男女性别的不同， 而且妊娠对自身免疫病的发生、 发展也有重要的影响［1］， 这使人们认识到性激素， 尤其是雌孕激素对免疫系统有重要的调节作用。研究发现在绝大多数的免疫器官组织中都能找到雌激素受体的存在［2-4］， 我们以前的研究表明， 雌激素能抑制T、B淋巴细胞增殖并诱导凋亡［5， 6］， 但其作用机制仍不清楚。本实验通过不同浓度的雌激素刺激B淋巴细胞系IM9细胞， 探讨雌激素对B淋巴细胞免疫功能的影响， 为临床雌激素替代治疗甚至自身免疫病治疗提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　IM9细胞系购自美国ATCC公司。17β雌二醇为美国Sigma公司产品。超绝UNIQ10柱总RNA抽提试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司。Annexin VFITC凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT增殖实验

　　将生长状态良好的IM9细胞制备成1×109/L的细胞悬液， 以每孔100 μL接种于96孔板， 实验设空白组、10-6 mol/L E2组、10-5 mol/L E2组10-4 mol/L E2组。置37℃、50 mL/L CO2培养箱内培养72h， 于培养结束前4 h， 每孔加入5g/LMTT10 μL， 酶标仪上检测492 nm处的吸光度(A)值。

　　1.2.2 RTPCR扩增IgG

　　用超绝UNIQ10柱总RNA抽提试剂盒提取IM9细胞总RNA， 操作按说明书进行。RTPCR扩增IgG， 引物序列如下: 上游5′CCATGGAGTTGGGGCTGAGCTGG3′; 下游5′GGGCACCAGGGGGAAGAC3′， 产物大小为465 bp。PCR反应条件为: 95℃预变性5 min， 95℃变性1 min， 60℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 共30个循环， 最后72℃再延伸5 min。取扩增产物10 μL电泳并在紫外灯下观察。

　　1.2.3 FCM检测细胞凋亡

　　不同浓度的E2刺激IM9细胞72h后， 用Annexin VFITC凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况， 操作按试剂盒说明进行。

　　1.2.4 RTPCR扩增Bcl2及Bax RNA提取和逆转录同上。Bcl2及Bax引物序列如下: Bcl2: 上游5′CTGTACGGCCCCAGCATGCG3′;下游5′GCTTTGTTTCATGGTACATC3′， 产物大小为96 bp; Bax: 上游5′GGGAATTCTGGAGCTGCAGAGGATGATT3′; 下游5′GCGGATCCAAGTTGCCATCAGCAAACAT3′， 产物大小为231 bp。 PCR反应条件为: 94℃预变性5 min， 94℃变性30 s， 58℃或62℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 共30个循环， 最后72℃再延伸10 min。取扩增产物10 μL电泳并在紫外灯下观察。

　　1.2.5 统计学分析

　　实验数据采用SPSS12.0统计分析软件进行分析， 实验数据皆采用x±s， 方法用方差分析， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度E2对IM9细胞增殖反应的影响

　　不同浓度的E2(10-6～10-4 mol/L)对IM9细胞有明显的抑制作用， 呈剂量依赖性（图1）。
　
　　2.2 不同浓度E2对IM9细胞IgG产生的影响

　　与对照组比较， 不同浓度的E2（10-6～10-4 mol/L）均明显抑制IM9细胞免疫球蛋白IgG的产生， 也呈现剂量依赖性（图2）。

　　2.3 不同浓度E2对IM9细胞凋亡的影响

　　不同浓度的E2 (10-6～10-4 mol/L)刺激IM9细胞在72后FCM检测可见E2刺激组细胞凋亡率明显增加（图3）， 凋亡率依次为对照组（5.21±0.28）%， 10-6 mol/L E2组（14.35±0.67）%、 10-5mol/L E2组（22.21±1.09）%、 10-4 mol/L E2组（37.66±1.39）%。

　　2.4 不同浓度E2对IM9细胞凋亡相关基因Bcl2和Bax的影响
　　RTPCR检测Bcl2和Bax显示， E2刺激B淋巴细胞后Bax基因的表达逐渐增强; 而Bcl2的基因表达及Bcl2/Bax表达比则逐渐减弱(图4)。

　　3 讨论

　　雌激素是人体主要生殖激素之一， 具有促进女性生殖器官发育和成熟、 维持女性性征和调节生殖功能的作用。目前国内外的研究认为雌激素在免疫器官和免疫细胞的发育和功能上也发挥着重要的作用。雌激素对T细胞的研究报道较多， 雌激素可以降低胸腺重量， 雌激素替代疗法可以使CD8+T细胞明显减少、 CD4+/CD8+T细胞升高， 其机制可能是通过Fas/FasL途径及上调Bax基因表达诱导细胞凋亡［7］。本研究用不同浓度的雌激素作用于IM9细胞， 探讨雌激素对B淋巴细胞的调节作用。本实验中首先用MTT比色分析法观察E2对IM9细胞增殖的影响， 证实E2明显抑制IM9细胞的增殖呈现剂量依赖性。IM9细胞是一种B淋巴细胞， 能合成和分泌免疫球蛋白IgG， 为了探讨雌激素对B淋巴细胞免疫球蛋白分泌的影响， 我们在mRNA水平检测了IgG的表达， 结果显示E2明显抑制IM9细胞IgG的产生。
　　
　　我们用FCM检测E2作用IM9细胞后凋亡情况发现各E2处理组均存在， 这提示E2抑制IM9细胞增殖是通过诱导细胞凋亡而实现的， 与Sakazaki等［8］报道的高浓度(10-5 mol/L)的E2可诱导小鼠脾细胞发生明显凋亡， 且不能被ConA或LPS逆转的结果相一致。
　　
　　细胞凋亡是一种受基因调控的程序性细胞死亡， BCL2基因家族对凋亡的调控作用尤为重要。Bcl2家族包括两类成员， 一类如Bcl2、 Bclxl等是抑制凋亡发生的， 另一类如Bax、Bak等是促进凋亡发生的。BCL2和Bax对细胞凋亡相反的调控作用是相互联系的， BCL2/Bax比值的高低是决定对细胞凋亡发挥何种作用的关键因素［9］。本研究结果显示， 与对照组相比， E2组BCL2的表达随着E2浓度增高而降低， 而Bax表达则相反， 进而使BCL2/Bax比值降低， 促进IM9细胞凋亡的发生， 这可能是E2致IM9细胞凋亡的原因之一.
　　
　　总之， 本研究探讨了高浓度的E2可以抑制IM9细胞的增殖， 并下调其IgG的表达， 这种抑制作用至少部分是通过调节凋亡相关基因BCL2、 Bax而诱导细胞凋亡。

　　致谢: 此研究在新乡医学院免疫学研究中心完成， 感谢王辉教授给予的指导和帮助。

参考文献

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　　［5］宋向凤， 孙翔， 王辉. 雌孕激素对T淋巴细胞生长的调节作用［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2005， 21(2): 249-253.

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　　［8］Sakazaki H， Ueno H， Nakamuro K， et al. Apoptosis Induction of Mouse Splenic Cells by Exposure to HighLevel 17βEstradiol and Endocrine Disrupting Chemicals［J］. J Health Sci， 2004， 50(3): 248-256.

　　［9］Song RX， Zhang Z， Mor G， et al. Downregμlation of Bcl2 enhances estrogen apoptotic action in longterm estradioldepleted ER(+) breast cancer cells［J］. Apoptosis， 2005， 10(3): 667-678.