外周血单核细胞诱导的CD123+髓系树突状细胞的特性研究

　　　　　　 作者：石军， 王敏， 万云， 池田和真

【摘要】 　　目的: 探讨体外髓系培养体系中外周血单核细胞来源的CD123+髓系树突状细胞（mDC）的生物学特性。方法: 分离健康人外周血单核细胞， 用重组的粒/单核细胞集落刺激因子（GMCSF）和白细胞介素4（IL4）将其诱导为树突状细胞（DC）。用流式细胞术（FCM）检测DC表面共刺激分子、 CD304 、 CD123和CD11C的表达， 并用间接免疫磁珠法将其中CD123+DC加以分离纯化; 激光共聚焦显微镜、 扫描电镜观察CD123+DC形态; ELISA法检测CD123+DC的IL12 分泌量; 葡聚糖吞噬试验和3HTdR渗入法分别检测CD123+DC的吞噬功能和对同种异体T细胞的刺激能力。结果: 外周血单核细胞经GMCSF和IL4诱导7 d后， 细胞表面高度表达CD86和CD11C， 中等量表达CD1a和CD123， 低表达CD83， 丧失CD14的表达， 其中， CD123和CD11C均匀分布于DC表面。免疫磁珠纯化后的CD123+DC呈现典型的不成熟DC形态， 除细胞体积较小外， 其表面突起类似于CD123-DC。CD123+DC仅微量分泌IL12， 其吞噬能力强于CD123-DC（P&<0.05）， 但抗原刺激功能低于后者（P&<0.05）。结论: GMCSF和IL4培养体系中的CD123+DC可能是DC分化发育过程中更早期的未成熟mDC， 具有独特的生物学特性。

【关键词】 髓系培养体系; 髓系树突状细胞; CD123

　　［Abstract］AIM: To investigate the biological characteristics of CD123+DC derived from cord blood monocytes in myeloid culture system. METHODS: The monocytes isolated from peripheral blood were cultured with GMCSF and IL4 to induce DC for 7 days， and the related phenotype of DC was analyzed by flow cytometery. CD123+DC were purified with magnetic cell sorting separation technique. The morphological properties of CD123+DC was observed under confocal laserscanning microscope and scan electron microscope. The concentration of IL12 secreted by DC was analyzed by ELISA. The function of endocytosis and antigen presentation was evaluated by uptaking FITCdextran and allogeneic mixed T lymphocyte reaction (MLR). RESULTS: FACS analysis showed the high expression of CD86 and CD11C， moderate expression of CD1a and CD123， low levels of CD83 on DC after induction by GMCSF and IL4 for 7 days， while the expression of CD304 was rather low. Welldistributed CD123 and CD11C were detected on DC. Purified CD123+DC showed typical morphology of immature DC with similar short cytoplasmic projections as CD123-DC. CD123+DC secreted lower level of IL12， and exhibited more significant endocytosis and less antigen presentation function than that of CD123-DC（P&<0.05）. CONCLUSION: CD123+DC induced with GMCSF and IL4 might be more early phase of immature myeloid DC along with the DC differentiation， with special biological characteristics.

　　［Keywords］myeloid cultured system; myeloid dendritic cell; CD123

　　树突状细胞（dendritic cell， DC）是功能强大的专职抗原提呈细胞， 将体外培养的DC回输到患者体内， 以激发机体产生明确的抗肿瘤免疫应答， 已成为有效的临床抗肿瘤治疗手段之一。根据其表面标记， DC分为髓系DC（myeloid DC， mDC)和浆细胞样DC（plasmacytoidDC， pDC）两个大的亚群， 前者主要用于抗肿瘤免疫治疗， 后者主要参与免疫耐受［1］。DC是个非均质性的群体， 最近， 在体外诱导的mDC表面发现淋巴系DC特异性标记CD123的高度表达， 但这群兼具髓系和淋巴系标记的DC是否为一个特殊的亚群尚未见报道。我们将外周血单核细胞诱导的髓系CD123+DC加以分离纯化， 结合细胞形态、 表面标记和对T细胞的刺激功能对其生物学特性进行研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　采集健康自愿者外周血50 mL， 肝素抗凝。白细胞介素4（recombinant human interleukin4， rhIL4）由日本盐野制药公司惠赠。重组人粒/单核细胞集落刺激因子（recombinant human Granulocyte macrophage colonystimulating factor， rhGMCSF）购自美国RHC公司。FITC、 APC或 PE标记的鼠抗人单克隆抗体(mAb）购自美国 PharMingen 公司。 鼠抗人CD14、 CD4及PE的免疫磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司。FITCdextran (Mt 40×103)及IL12免疫酶联吸附测定（ELISA）试剂盒分别购自美国Sigma公司和eBioscience 公司。流式细胞仪及激光共聚焦显微镜（LSM510型）分别为美国Becton Dickinson及Zeiss公司产品。

　　1.2 方法

　　1．2．1 DC的体外诱导

　　将外周血用淋巴细胞分离液密度梯度离心（20℃， 400 g， 30 min）， 获取单个核细胞后， 按常规方法用鼠抗人CD14免疫磁珠筛选单核细胞。将CD14阳性细胞在含有rhGMCSF（800 万U/L）和IL4（100 万U/L）的培养液中调整密度为1×109/L， 加入6孔培养板， 置于含50 mL/L CO2、饱和湿度、 37℃培养箱中培养， 隔天半量换液， 并用双相倒置显微镜观察细胞形态的变化。

　　1．2．2 DC的表型测定

　　以流式细胞术（FCM）检测DC表面标志。将DC悬浮于冷PBS中， FITC标记的抗人CD86、 CD83、 CD11C 、 CD14及CD1a的mAb， PE标记的CD123， APC标记的CD304， 对照为FITC、 PE或APC交联的同型对照抗体。抗体1∶10（10 μL/5×105DC）稀释， 4℃避光孵育30 min， 其中一个样品为CD123PE和CD11CFITC双染色。洗涤2次， 重新悬浮。每个细胞均根据FITC及PE的荧光激发特性进行单标记或双标记参数分析， 每个样品分析细胞数&>1×104。另将双标记组细胞悬液滴片， 100 g/L缓冲甘油封片， 置共聚焦显微镜下观察DC表面CD123和CD11C分布情况。

　　1．2．3 间接免疫磁珠分选

　　CD123+DC 将培养第7天的DC由培养板中取出， 加入PE标记的鼠抗人CD123抗体（2 μL/106细胞）， 4℃孵育30 min， 充分洗涤后加入磁珠连接的抗PE抗体， 4℃孵育15 min， 通过阳性分选柱， 得到的阳性细胞命名为分CD123+DC， 阴性组分命名为CD123-DC。

　　1．2．4 扫描电镜形态学观察

　　将CD123+DC按照常规法爬片， 用30 mL/L戊二醛固定， 经乙醇梯度脱水， 临界点干燥， 真空镀金胶体后置于扫描电镜下观察， 并与CD123-DC进行比较。

　　1．2．5 IL12含量测定

　　分离纯化后的CD123+DC和CD123-DC分别用DC条件培养液调整细胞密度至5×108/L， 继续培养24 h， 收集上清， 按照ELISA试剂盒说明书， 检测IL12含量， 每组设3个复孔。

　　1．2．6 吞噬功能测定

　　将CD123+DC和CD123-DC分别与FITCdextran（0.5 g/L）37℃孵育1 h， 用PBS洗涤5次后置流式细胞仪上检测。

　　1．2．7 CD123+DC对同种异体T细胞增殖的影响

　　采用常规磁珠分选方法， 用抗CD4磁珠从外周血单个核细胞中分选CD4+T细胞， 用RPMI1640培养液离心洗涤， 调整细胞密度为1×109/L， 每孔100 μL接种到96孔培养板。将CD123+及CD123-DC用γ射线照射灭活， 与T细胞以1∶10比例混合培养， 同时以未加DC的T细胞为对照组， 每组设3个复孔， 置37℃培养5 d。于培养结束前16 h加入3HTdR（0.5 μCi/孔）， 收集细胞后用液闪仪检测cpm值， 结果取3个孔的平均值。

　　1．2．8 统计学分析

　　计量资料以x±s表示， 两均数比较采用t检验， P&<0.05时有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 DC的表型

　　外周血单核细胞培养7 d后， 单核细胞特异性标记CD14几近消失(未显示)， 共刺激分子CD86高表达， 但成熟标记CD83低表达， 部分细胞表达CD1a（图1）， 结合典型之DC形态， 表明单核细胞已被诱导为DC。几乎所有的细胞均表达髓系标记CD11C， 其中， 21.3%的细胞表达CD123， 但均不表达体外诱导的pDC的特异性标记CD304。

　　2.2 CD123+DC的纯化效果

　　采用间接免疫磁珠阳性分离法。CD123阳性细胞在分离前初始含量38.2%， 经MiniMACS分离纯化， 纯度达到98.0%(图2)。

　　2.3 CD123+DC的形态

　　CD14+单核细胞在GMCSF和IL4的联合作用下， 于培养第2天开始出现不规则形态的细胞， 少数贴壁生长， 大部分细胞悬浮生长; 于培养第7天时细胞体积已明显增大， 表面伸出许多毛刺， 大部分细胞悬浮不贴壁， 部分聚集成簇。分离纯化后， 扫描电镜下可见CD123+DC体积明显小于CD123-DC， 二者胞体均形成不规则突起， 细胞表面微绒毛消失， 表面粗糙， 树根状突起明显可见， 呈典型的不成熟DC形态（图3）; 在激光共聚焦显微镜下观察， CD123及CD11C均匀分布于DC表面， 同时显示CD123+DC体积较小（图4）。

　　2.4 CD123+DC的吞噬功能

　　CD123+DC能有效内化FITCdextran， 其内吞率和CD123-DC相当， 都近100%(图5)， 但前者的荧光强度为1011.0±143.9， 明显高于后者的576.3±128.9（P&<0.05）。

　　2.5 CD123+DC分泌

　　IL12 分离纯化后的CD123+DC继续培养24 h后， 其培养上清液中仅检测到微量的IL12(分泌量12.7±5.4 ng/L)， 与CD123-DC(IL12分泌量22.8±13.2 ng/L)无明显差异（P&>0.05）。

　　2.6 CD123+DC激发同种异体T细胞增殖 取纯化后CD123+和CD123-DC同等细胞量， 分别与异体外周血T细胞以1∶10比例混合培养5 d， 结果表明， CD123+DC刺激T细胞增殖(cpm平均值为50)较对照组(cpm值为2)强（P&<0.001）， 但其刺激能力较CD123-DC组(cpm平均值为74)低， 差异有统计学意义（P＜0.05）。

　　3 讨论

　　DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞， 其分化发育及抗肿瘤应用尤其受到人们的关注。按其表面标记和功能， DC分为髓系mDC和pDC两个大的亚群， 前者高度表达CD11C等髓系标记， 具有免疫佐剂作用， 已被广泛应用于肿瘤的基础和临床治疗研究［2］; 后者表面高度表达CD123， 具有免疫调节和诱导免疫耐受功能， 国外已将研究应用于自身免疫性疾病和移植排斥反应的免疫预防和治疗［3］。mDC的来源有两类， 一类是CD34+干细胞， 另一类是CD14+单核细胞， 在体外培养中， 经某些细胞因子直接诱导发育为DC。现已证明体外培养的DC与体内纯化的DC一样具有抗原提呈功能。由GMCSF和IL4联合组成的培养方案被认为是mDC经典的体外诱导体系。GMCSF能使单核细胞向DC及巨噬细胞分化， IL4则能抑制巨噬细胞形成， 促使DC定向诱导分化， 并能维持DC于未成熟状态， 使其具有很强的处理外源性抗原的能力［4］。传统的mDC概念提示mDC表面高度表达髓系标记， 不表达或者仅低表达CD123［3］; 而以IL3为基础的培养体系， 主要诱导pDC， 其表面高度表达CD123， 而缺乏CD11C等髓系标记［5］， 从而使CD123和CD11C成为区分人类浆系和mDC的主要标志。
　　
　　本实验中以髓系培养体系GMCSF和IL4体外诱导外周血单核细胞生成DC， 培养7d后DC高度表达共刺激分子CD86， 而丢失单核细胞标志CD14， 表明已成功诱导出DC， 但成熟标记CD83的低表达， 表明DC仍处于不成熟阶段。DC分化过程中有一个从不成熟到成熟的过程， 不成熟DC具有很强的抗原摄取能力， 但分泌IL12及刺激初始型T细胞的能力较弱。在这群未成熟DC表面， 我们检测到CD123高度表达， 它是IL3受体α链， 目前认为其主要表达于pDC、 髓系祖细胞、 嗜碱细胞、 肥大细胞、 巨噬细胞等。而Ward等［6］用含有GMCSF和IL4的培养液从CD34+细胞体外诱导的mDC上同样发现CD123高表达， 与本实验对外周血mDC的发现相符。我们进一步将CD123+DC用免疫磁珠加以纯化， 光镜和电镜下观察发现， CD123+DC呈现典型的不成熟DC形态， 除细胞体积较小外， 其表面突起类似于CD123-DC， 明确了CD123+DC是以小细胞为主的一群未成熟DC细胞。与我们在脐带血单核细胞诱导的CD123+DC的检测结果相似［7］。我们在CD123+DC表面并没有发现pDC的另一特异性标记CD304（BDCA4）， 而后者几乎表达于所有常规体外诱导的pDC表面［8］， 结合FACS检测结果， CD123+DC同时表达髓系CD11C抗原， 更加提示其为髓系来源的DC， 而并非pDC。
　　
　　我们进一步检测了CD123+DC的功能特点， 结果表明， CD123+DC仅微量分泌Th1型细胞因子IL12， 与CD123-DC相比， CD123+DC具有较强的吞噬功能， 而对同种异体T细胞的刺激能力较弱。因此， 推测GMCSF和IL4培养体系中的CD123+DC是mDC分化发育的一个阶段， 可能为更加不成熟的mDC。免疫治疗中的这部分细胞作为早期未成熟mDC进入人体后能否正常发挥抗肿瘤免疫功能尚有待进一步研究。

参考文献

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