负载人HUVECs抗原的DC疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应

　　　　 作者：赵军， 翟景明， 路静， 杨洪艳， 黄幼田， 李珊， 董子明， 张曦

【摘要】 　　目的: 探讨负载人脐静脉内皮细胞（HUVEC）抗原的DC疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应。方法: 原代培养和鉴定人HUVECs， 制备抗原， 负载树突状细胞（DC）， 免疫小鼠， 免疫结束后1周小鼠皮下注射小鼠宫颈癌U14细胞， 观察肿瘤生长大小、 检测免疫后小鼠脾细胞体外CTL效应、 表面CD3+CD8+百分率和血清抗体滴度， 通过细胞免疫组化和Western blot血清特异性反应分析。结果: 经免疫组化鉴定成功培养出纯度高的HUVECs， 抗原负载DC并注射BALB/c小鼠后， PBS组肿瘤生长最快， DC组和HUVECDC组肿瘤也有生长， 但生长较慢， 在2周后HUVECDC组肿瘤消失， 3周后DC组肿瘤消失。小鼠脾细胞体外CTL结果显示HUVECDC组有明显的特异性杀伤HUVEC的作用。CD3+CD8+百分比提示HUVECDC组细胞毒性T细胞比例较其他两组高。小鼠血清抗体滴度示有抗体产生， 免疫组化检测示组与HUVEC有特异性抗原抗体反应， Western blot显示在相对分子质量（Mr）130 000和220 000处有特异性条带。结论: 负载人HUVECs抗原的DC疫苗和DC疫苗对小鼠宫颈癌U14有抑制作用， HUVECDC疫苗诱导了小鼠的细胞和体液免疫， 并诱导了针对HUVECs细胞中的某些抗原的应答， 这些抗原可能是整合素αν和VEGFR2。

【关键词】 人脐静脉内皮细胞抗原; 树突状细胞; 小鼠宫颈癌; 特异性免疫反应

　　［Abstract］AIM: To explore the specific immunity of dendritic cell (DC) vaccine loading human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) antigen.against U14 cervical cancer of mice. METHODS: Primary HUVECs were cultured， identified and made into antigen. The BALB/c mice were immuned with DCs loading HUVEC antigen 4 times a week. One week after last vaccination， U14 cervical cancer cells were injected subcutaneously into the mice. The tumor size， CTL response of spleen lymphocytes in vitro， the percentage of CD3+CD8+ surface markers of spleen lymphocytes， and the titer of serum antibody were detected. The specific immunity was examined by immunocytochemistry and Western blot. RESULTS: HUVECs with high purity were successfully cultured and by identified by immunocytochemistry and RTPCR. After the vaccine was injected into mice， the tumors of mice in PBS group grew faster than the those in other groups. The tumors of mice in HUVECDC groups grew slowly and disappeared after 2 weeks and The tumors of mice in DC group disappeared after 3 weeks. The CTL response of spleen lymphocytes in vitro showed that HUVECDCT cells could kill HUVEC cells. The percentage of CD3+CD8+ surface markers of spleen lymphocytes in HUVECDC group was higher than that in other groups. The titer of serum antibody was 1∶800. immunocytochemistry analysis indicated HUVECDC group had specific antigenantibody reaction to HUVECs through and Western blot analysis revealed there were specific bands at 130 KDa and 220 KDa. CONCLUSION: HUVECDC vaccine and DC vaccine can inhibit the tumor growth of U14 cervical cancer of mice. The special cellular and humoral immunity are induced by HUVECDC vaccine. Furthermore， some antigens in HUVECs maybe have special immune reaction with integrin α ν and VEGFR2.

　　［Keywords］human umbilical vein endothelial cell antigen; dendritic cell; cervical cancer of mouse; specific immunity response

　　肿瘤血管的生成是肿瘤生长和转移的必要条件。在成年人， 血管生成处于相对静止状态， 而在缺氧的情况下， 肿瘤细胞可以通过分泌内皮细胞生长因子打破此状态形成新血管， 肿瘤新生血管与静止期的正常血管的区别就在于其表达血管生成相关抗原［1］， 虽然， 靶向自身血管生成的单克隆抗体(mAb)和人工合成分子在动物实验中抑制了肿瘤的生长， 但由于其半衰期短， 作用单一， 往往需要联合和长期治疗， 而且特异性高的抗原分子仍有待分离。2000年， Wei等［2］运用异种血管内皮细胞疫苗进行抗肿瘤血管治疗取得了很好的疗效， 但Yoneyama等［3］研究发现在治疗过程中有的效果则不是很理想， 为了增强疫苗的效果， 我们假设用负载异种血管内皮细胞人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell， HUVEC）抗原的树突状细胞（dendritic cell， DC）免疫小鼠， 观察其诱导小鼠对宫颈癌U14的特异性免疫反应， 并初步研究其机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　内皮细胞培养基（ECM培养基）购自ScienCell公司， DMEM购自Gibco公司， 胎牛血清购自天津TBD公司， 胰蛋白酶购自Amresco公司， 兔抗人vWF抗体为Santa Cruz公司产品， 兔抗人CD144抗体为Cell Signaling公司产品， 即用型DAB免疫组化试剂盒、 浓缩型DAB试剂盒， 牛血清白蛋白、明胶， 考马斯亮蓝G250均购自Sigma公司， TRIzol购自Invitrogen公司， 小鼠GMCSF购自杭州隆基公司， 小鼠IL4 、 IL2购自Peprotech公司， CCK8 kit购自日本株式会社同仁化学所， HRPIgG购自武汉博士得公司， FITCCD3ε和PECD8α单克隆抗体（mAb）购自Biolegend公司， BALB/c小鼠30只（6～8周龄， 体质量16～18 g， 购自郑州大学动物中心， 许可证号: SCXK豫2005～0001）， 小鼠宫颈癌U14瘤株购自中国医学科学院实验动物研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 原代人HUVECs分离培养

　　健康孕妇产后立即取新生儿脐带置入生理盐水中， 长约15～20 cm， 4 h之内行HUVECs分离培养。用含青、链霉素生理盐水冲洗脐静脉至冲洗液呈无色清亮时， 向脐静脉内灌注2.5 g/L胰蛋白酶， 置细胞培养箱中10～15 min后收集消化液， 1 200 r/min， 离心8 min， 细胞重悬于ECM中， 接种于明胶包被的培养瓶中， 置37℃、50 mL/L CO2培养箱中培养。24 h后弃培养液， PBS液轻洗1次， 除去红细胞及未贴壁细胞， 加ECM继续培养， 2～3 d 换液1次， 2～3 d可长成单层细胞。生长汇合至80%后， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化， 1∶2传代继续培养2～3 d换液1次。

　　1.2.2 免疫细胞化学检测vWF、CD144鉴定原代人HUVECs
　　将人HUVECs细胞接种96孔板， 过夜培养。40 g/L多聚甲醛固定30 min。vWF组需加2.5g/L Tritonx100透膜。然后加h3O2(300 mg/L h3O2∶甲醇=1∶50)， 室温30 min， BSA封闭30 min。吸去BSA， 加兔抗人vWF和CD144抗体， 盖底即可。4℃过夜。第2天， 吸去一抗， 加生物素化抗羊抗兔IgG二抗， 室温20 min， 加SABC室温20 min， 加DAB 30 min， 显微镜观察染色程度。苏木精染色1～2 min， 用相差倒置显微镜拍照， 再用Biosens Digital Imaging System灰度扫描仪扫描以检测vWF和CD144抗原水平。

　　1.2.3 原代人HUVECs抗原的制备

　　收集培养的人HUVECs， 调整密度1×1010/L， PBS重悬， 液氮冷冻5 min后立即放入37℃水浴中5 min， 反复4次。4℃， 10 000 g， 离心30 min， 收集上清。按Brad～ford蛋白定量法， 收集的上清取50 μL与考马斯亮蓝950 μL混匀， 静置3 min， 用UNICOUV2102PCS系统分别检测抗原的吸光度（A）， 然后根据标准曲线进行浓度计算。

　　1.2.4 小鼠骨髓DCs的培养和鉴定

　　参照文献方法［4］， 略有改动。拉颈处死BALB/c小鼠， 无菌剥离股骨和胫骨。用注射器将骨髓冲出， 离心收集骨髓细胞， 加入预温的TrisNH4CL裂解红细胞， 然后用含100 mg/L FCS的RPMI1640完全培养液（含rmGMCSF（10 μg/L）和rmIL4（5 μg/L）调整细胞密度为3×109/L， 以1 mL/孔加入接种于24孔培养板。置37℃、 50 mg/L CO2的孵箱中培养48 h后弃去悬浮细胞， 隔日半量换液， 每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。收集培养至第7天的DC， 调细胞密度为2×108/L， 分别加入1 μL FITC标记的CD86和PE标记的CD11a抗小鼠mAb。设立空白对照， 4℃避光反应30 min。洗涤后上流式细胞仪检测。

　　1.2.5 负载人HUVECs抗原的DCs疫苗免疫小鼠

　　DCs培养第3天， 加入人HUVECs抗原100 mg/L， 继续培养至第6天， 加入脂多糖， 隔日半量换液， 第8天， 用胰酶消化法收集DCs， PBS洗2次， 重悬调密度5×109/L， 此为HUVECDC疫苗， 直接BALB/c小鼠皮下注射。BALB/c小鼠分为3组: PBS组， DC组， HUVECDC组。每组10只。共免疫4次， 每周1次， 最后1次免疫后7 d， 皮下注射小鼠宫颈癌U14细胞1.5×106/只， 同时， 乙醚麻醉各组小鼠摘眼球取全血， 室温放置1 h， 4℃过夜， 收集上清， 4℃保存作为免疫小鼠血清。触及肿瘤后每3 d测量肿瘤大小， 称量小鼠重量， 游标卡尺测量肿瘤大小， 肿瘤体积V (mm3) = 0. 5ab2， a为长径(mm)， b为短径(mm) 。待1只小鼠死亡后全部处死小鼠取出肿瘤， 称重， 测其体积， 观察疫苗对小鼠U14细胞皮下肿瘤的抑制作用。

　　1.2.6 诱导小鼠对UI4细胞的细胞和体液免疫应答

　　（1）免疫小鼠脾淋巴细胞分离: 拉颈处死各组小鼠后无菌取脾脏， 研磨成单细胞， 经孔径200 μm尼龙筛过滤， 用Dhank’s液2.5 mL重悬， 沿管壁轻轻加至4 mL小鼠淋巴细胞分离液上， 1 700 r/min， 离心15 min， 取白膜层， 用TrisNH4Cl裂解红细胞， 经尼龙毛柱洗脱后用含100 mg/L小牛血清RPMI1640重悬。(2)荷瘤后CD3和CD8表达: 各组脾淋巴细胞用100 μL 100 mg/L小牛血清RPMI1640重悬， 加FITC标记的CD3εmAb 1μL和PE标记的CD8αmAb 2.5μL， 4℃避光反应30 min， 100 mg/L小牛血清的PBS洗2次， 1 mL重悬上流式细胞仪检测。(3)ELISA检测抗体滴度: 取96孔可拆式酶标板， 将HUVEC总蛋白用包被缓冲液稀释(3 mg/L)， 加入板孔中(100 μL/孔)， 4℃包被过夜。每组设5个复孔， 弃包被液， 加封闭液， 37℃封闭2 h。弃封闭液， 用洗涤液洗6次， 每次2 min。加入稀释液稀释的1∶50， 1∶100， 1∶200， 1∶400， 1∶800， 1∶1 600， 1∶3 200和1∶6 400抗血清（免疫小鼠血清）， 并设阴性对照组（只加PBS）， 40 μL/孔， 37℃孵育1 h。弃去抗血清， 用洗涤液洗6次， 每次2 min。加入HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗， 稀释液稀释（1∶10 000）， 50 μL/孔， 37℃孵育30 min。弃去二抗， 用洗涤液洗6次， 每次2 min。加入底物显色液(TMB: A+B混匀)， 100 μL/孔， 37℃， 显色10～20 min。加入终止液， 50 μL/孔， 终止反应。酶标仪读数， 测定每孔A450值。空白对照调零， P/N≥2.1， 判为阳性(P: 阳性抗原孔A值， N: 阴性抗原孔A值)。

　　1.2.7 诱导小鼠对UI4肿瘤血管的特异性免疫应答

　　（1）脾淋巴细胞CTL实验: 各组脾淋巴细胞用100 μL 100 mg/L小牛血清RPMI1640重悬， HUVECs常规培养， 胰酶消化后作为靶细胞。以脾淋巴细胞: 靶细胞=50∶1和25∶1将细胞种于96孔板， DC和PBS组作对照， 37℃， 50 mg/L CO2共培养24 h， 在最后4 h， 加入CCK810μL/孔， 用酶标仪检测A450值。(2)免疫细胞化学检测: 将HUVEC细胞接种于96孔板上， 培养过夜， 40 g/L多聚甲醛固定30 min。然后加h3O2(300 mL/L的h3O2∶甲醇=1/50)， 室温30 min， BSA封闭30 min。吸去BSA， 加入免疫小鼠血清（1∶10）为一抗。4℃过夜。第2天， 吸去一抗， 加羊抗小鼠HRPIgG二抗， 室温20 min， 加DAB 30 min， 显微镜观察染色程度。用相差倒置显微镜拍照， 再用Biosens Digital Imaging System灰度扫描仪扫描分析。(3)Western blot检测VEGFR2和整合素αν: 提取HUVEC细胞总蛋白， 按考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测总蛋白含量， -80℃储存备用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳: 制备100 g/L分离胶和50 g/L的浓缩胶， 取待测的样品各50 μg及蛋白分子质量标准上样电泳。采用半干式电转移法。将蛋白转移至PVDF膜上。室温封闭（50 g/L BSA）3 h后分别加入免疫小鼠血清作为一抗(1∶25)， 4℃过夜。TBST洗膜3次 ， 加入羊抗小鼠HRPIgG二抗， 室温孵育1 h。TBST 洗膜后， ECL显色， 暗室压片成像。GelDoc紫外凝胶成像分析系统计算各条带的灰度值(Quantity One 1D Analysis Software)。

　　1.2.8 安全性观察

　　实验过程中， 每周称小鼠体重， 观察小鼠皮毛色泽， 食欲、 粪便及活动变化。小鼠处死后观察肝、肺、肾等脏器变化。

　　1.2.9 统计学分析

　　采用SPSS10.0统计软件包， 所有资料均为计数资料， vWF、 CD144、CD31免疫组化和抗原浓度数据分析用x±s表示， 分别采用t检验和单因素方差分析， 以P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 原代人HUVECs的形态学观察

　　多呈小三角形、短梭形， 2～3 d汇合成单层， 细胞边界清楚， 胞质丰富， 胞核呈圆形或椭圆形， 偶见双核， 密集处呈铺路石状镶嵌排列， 稀疏处为短梭形。传代培养的细胞形态饱满， 伸展呈长梭形， 漩涡状排列生长（图1）， 细胞贴壁牢固; 细胞传至第5代出现管腔样结构。

　　2.2 人HUVECs标志vWF、CD144的表达

　　DAB染色以胞质着棕黄色颗粒为主的为vWF阳性细胞（图2A）; DAB染色以胞膜着棕黄色颗粒为主的为CD144（图2B）。

　　
　　2.3 小鼠骨髓源DCs的形态

　　培养前48 h尽量少看细胞， 第3天， 可见部分细胞较种板时变大， 部分细胞贴壁， 呈长梭形（图3A）， 第5天， 几乎80%细胞贴壁， 有的细胞可见3～4个突起， 第7天， 部分细胞变圆， 但仍可见较多细胞贴壁， 可见集落形成， 此为成熟的DCs（图3B）。

　　2.4 小鼠骨髓源DCs表型的鉴定

　　FCM检测表明， 培养成熟的小鼠骨髓源DCs表达CD86和CD11a， 阳性率分别为65.77%、 37.51%。

　　2.5 免疫小鼠后肿瘤生长情况

　　HUVECDC疫苗免疫小鼠4次后7 d皮下接种小鼠宫颈癌U14细胞1.5×106/只， 分别在第5天可以在PBS组、DC组触及肿瘤， 肿瘤绿豆大小， 而HUVECDC疫苗组可触及小米粒大小肿块， 第8天， PBS组肉眼可看到肿瘤， 而DC组和肿瘤HUVECDC疫苗组无明显变化， 2周后， PBS组肿瘤体积3.375±0.335 cm3， 而HUVECDC疫苗组肿块消失， DC组肿瘤也逐渐缩小肿瘤体积0.06075±0.268 cm3， 于3周后消失。PBS组瘤体逐渐增大， 多在50 d左右破溃， 小鼠体重变化不大， 但极度消瘦， 生存期约(57.33±2.06) d。

　　2.6 小鼠对UI4细胞的细胞和体液免疫应答

　　2.6.1 免疫小鼠荷瘤后脾CD3和CD8T淋巴细胞亚群变化
　　接种肿瘤后第1只小鼠死亡后， 各组取1只小鼠处死后取脾脏， 分离脾脏淋巴细胞， 流式细胞术检测CD3+和CD8+T淋巴细胞百分率， 结果接种肿瘤后HUVECDC疫苗组和DC疫苗组CD3+和CD8+较PBS组明显升高， 以HUVECDC疫苗组最高(P&<0.05)， CD3+CD8+双阳性细胞百分率分别是PBS组(30.03±0.91)%， DC组(33.27±5.50)%， HUVECDC组(36.77±0.37)%。

　　2.6.2 ELISA检测抗体滴度

　　HUVECDC组免疫小鼠血清经过间接ELISA法测定滴度约1∶800， 为阳性， DC组和PBS组为阴性。

　　2.7 诱导小鼠对UI4肿瘤血管的特异性免疫应答

　　2.7.1 脾淋巴细胞CTL实验

　　将各组脾淋巴细胞加入CCK8 10μL/孔， 用酶标仪检测A450值， 重复3次， 取平均值。结果显示脾淋巴细胞: 靶细胞(HUVECs)=50∶1和25∶1的两组细胞的HUVECDC疫苗组明显有杀伤HUVEC效应（P&<0.05， 图4）， 而PBS组和DC组则无杀伤HUVEC效应（P&>0.05）。

　　2.7.2 免疫小鼠血清检测

　　进行细胞组化和Western blot检测后发现， HUVECDC组免疫血清与HUVEC细胞呈阳性反应， 在Mr 220 000和130 000处可见阳性条带， 而DC组和PBS组则呈阴性反应， 且没有条带（图5）。

　　2.8 安全性观察

　　实验过程中， 各组小鼠体重无统计学意义（P&>0.05）， 实验后期， PBS组小鼠出现皮毛干燥、杂乱、活动减少， 食欲、 粪便无明显变化。HUVECDC组和DC组小鼠皮毛、食欲、粪便及活动无明显异常。断尾取血后， 愈合好， 无明显的出血倾向。处死后观察肝、肺、肾、脾等脏器无明显变化。因此， 本疫苗具有良好的安全性。

　　3 讨论
　　
　　肿瘤血管生成是一个多步骤的复杂过程。现在认为肿瘤血管形成是促血管生成因子和血管生成抑制因子的平衡被打破的结果。肿瘤血管生成是多因子参与的过程， 在肿瘤发展的不同阶段发挥主导作用的调控因素不同［1］， 因此， 单纯阻断血管生成的某个环节所致的抑瘤作用必定有限。而运用整个血管内皮细胞做抗原， 则可避免单一抗血管治疗的方法的缺陷， 起到更好的治疗效果［4-6］。打破肿瘤血管生成的免疫耐受是抗肿瘤血管的主要治疗方法之一， 但治疗过程中仍然有的病例效果不理想， 改变抗原负载形式可能提高肿瘤治疗效果。
　　
　　机体对肿瘤细胞产生免疫耐受的主要原因是肿瘤细胞抗原性弱、不表达MHCⅡ类分子、共刺激分子和淋巴细胞黏附所需的分子， 因此T细胞无法识别和激活［7］。DC则在主动摄取肿瘤抗原后， 提供和增强T细胞激活的第一、二信号， 使T细胞有效的活化， 其中通过MHCI类分子途径主要是激活CD8+T细胞形成CTL， 而MHCⅡ类分子途径主要是激活CD4+ T形成Th1细胞［8］， 因此利用DC可成功的打破机体免疫耐受， 我们的实验结果也证实了这一点， 单纯DC免疫组在接受肿瘤细胞注射后， 激活CD8+T细胞， 同样也抑制了肿瘤的生长。
　　
　　小鼠宫颈癌U14是可移植的未分化鳞状细胞癌， 是实体瘤， 可以腹腔和皮下接种传代， 恶性程度高， 目前已广泛用于抗肿瘤药物筛选、 肿瘤免疫等领域的研究。

　　实验结果从宏观上看， HUVECDC组和DC肿瘤生长较慢， 而且逐渐消失， 可以称为“tumor free”［3］， 从脾CD3CD8T淋巴细胞亚群变化、 体外脾细胞CTL、 免疫血清组化和Western blot检测结果和Wei等［2］的结果相一致， 整个实验过程中， 小鼠无明显出血倾向， 疫苗对小鼠皮毛、 食欲、 粪便及活动无明显影响。
　　
　　增殖活跃的肿瘤血管内皮细胞表达相关基因有整合素αν［9］和VEGFR2［10］， 在静息期的内皮细胞表面呈低水平表达， 而在体外培养的增殖旺盛原代HUVECs有整合素αν和VEGFR2基因表达。整合素ανmAb和VEGFR2疫苗均可有效抑制肿瘤生长。我们的实验结果也诱导了小鼠体内特异的细胞和体液免疫， 而起到了抗肿瘤血管的作用。这种抗肿瘤血管生成和DCs的抗原提呈功能相结合的方法可以称为一种新的预防肿瘤生成的方法， 有望将这种方法运用于人类， 这也是我们的研究目标。

参考文献

　　［1］Okaji Y， Tsuno NH， Kitayama J， et al. Vaccination with autologous endothelium inhibits angiogenesis and metastasis of colon cancer through autoimmunity［J］. Cancer Sci， 2004， 95(1): 85-90.

　　［2］Wei YQ， Wang QR， Zhao X， et al. Immunotherapy of tumors with xenogeneic endothelial cells as a vaccine［J］. Nat Med， 2000， 6(10): 1160-1166.

　　［3］Yoneyama S， Okaji Y， Tsuno NH， et al. A study of dendritic and endothelial cell interactions in colon cancer in a cell line and small mammal model［J］. Eur J Surg Oncol， 2007， 33(10): 1191-1198.

　　［4］向邦德， 吕明德， 汤庆， 等. 树突状细胞体外诱导抗肿瘤血管内皮细胞特异性免疫的研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2005， 21(4): 495-498.

　　［5］Chen XY， Zhang W， Zhang W， et al. Vaccination with viable human umbilical vein endothelial cells prevents metastatic tumors by attack on tumor vasculature with both cellular and humoral immunity［J］. Clin Cancer Res， 2006， 12(19): 5834-5840.

　　［6］Yurai Okaji， Nelson H， Tsuno NH， et al， Pilot study of antiangiogenic vaccine using fxed whole endothelium in patients with progressive malignancy after failure of conventional therapy［J］. Eur J Cancer， 2008， 44(3): 383-390.

　　［7］Smyth MJ， Godfrey DI， Trapani JA. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy［J］. Nat Immunol， 2001， 2(4): 293-299.

　　［8］Roitt I(周光炎 主译).免疫学［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2002: 105-118.

　　［9］Herbst RS， Hidalgo M， Pierson AS， et al. Angiogenesis inhibitors in clinical development for lung cancer［J］. Semiarsin Oncology， 2002， 29(1): 66-77.

　　［10］Niethammer AG， Xiang R， Becker JC， et al. A DNA vaccine against VEGF receptor 2 prevents effective angiogenesis and inhibits tumor growth［J］. Nat Med， 2002， 8(12): 1369-1375.