CD1d四聚体检测NKT细胞

　　　　 作者：刘景华， 窦立萍， 王莉莉， 于力

【摘要】 　　目的: 建立一种检测小鼠NKT细胞的方法。方法: 首先将αGalCer负载于空的CD1d四聚体上。将αGalCer溶于1 000 mL/L的DMSO中， 配成浓度为0.1 g/L， 之后震荡αGalCer液， 37℃， 12 h， 用之前超声水浴37℃， 10 min， 取12 mol/L的上述αGalCer液加入到1 mol/L的四聚体溶液中， 将上述二者的混合液37℃， 避光， 孵育24～48 h。然后应用流式细胞术（FCM）检测正常的和腹腔注射αGalCer 5 μg 3 d后的小鼠的脾脏及骨髓中共表达αGalCer/CD1d四聚体及CD3的NKT细胞。结果: 在正常小鼠脾脏及骨髓的淋巴细胞中NKT细胞的比例分别为1.2%和1.6%; 腹腔注射αGalCer 5 μg 3 d后小鼠脾脏的淋巴细胞中NKT细胞有轻度的增加， 比例为2%和2.7%。结论: CD1d四聚体是检测小鼠NKT细胞的有效工具。

【关键词】 CD1d四聚体; NKT细胞; αGalCer

　　NKT细胞是1987年发现的一种新型的调节型T淋巴细胞， CD1d四聚体技术应用之前由于其研究工具的缺乏大大限制了对NKT细胞的研究， 尤其对于小鼠的NKT细胞的研究。在人类可以应用Vα24和Vβll进行双标从而确定NKT细胞， 但在小鼠由于其Vβ的多样性， 而不能应用Vα14和Vβ进行双标来确定NKT细胞。部分研究者将小鼠中CD3+NK1.1+的这一部分细胞认定为NKT细胞， 其实是不正确的［1］。因为在小鼠中除C57BL/6小鼠外其他小鼠并不表达NK1.1， 一些其他的T细胞（包括传统的病毒特异性的CD8+T细胞）能诱导表达NK1.1， 而且在体外实验中观察到NK1.1+ NKT细胞在αGalCer刺激后出现NK1.1的表达下调， 而表现为NK1.1-NKT细胞。荧光标记的CD1d四聚体可根据使用者的选择负载不同的CD1d配体， CD1d四聚体配体复合物结合NKT细胞的TCR， 从而应用流式细胞分析术（FCM）可进行NKT细胞的鉴定及计数。共表达CD1d四聚体和CD3或TCRβ的细胞即可认定为NKT细胞［2， 3］。国内尚无应用CD1d四聚体检测NKT细胞的研究。现将我们应用CD1d四聚体检测小鼠的脾脏及骨髓的NKT细胞的情况报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 3只C57BL/6N小鼠(8～12周龄， 体质量18～21 g， 雄性)， 购于北京维通利华实验动物技术有限公司， 许可证编号: SCXK（京）20070001。主要试剂: AntiCD3ePECY5及PE、 PECY5的同型阴性对照均购于BD Pharmingen公司; CD1d四聚体PE购于Proimmune公司; αGalCer购于Alexis公司; DMSO为Amresco产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 骨髓或脾脏单个核细胞的制备 乙醚麻醉小鼠（正常和腹腔注射αGalCer 5 μg 第3天）后将其浸泡于750 mL/L乙醇中消毒10 min， 取双侧股骨、 胫骨， 用剪子剪开股骨及胫骨的两干骺端， 用1 mL注射器反复冲洗骨髓腔， 并将冲液滤过200目金属网， 将上述制成的骨髓细胞悬液离心， 倒掉上清液， 之后加入红细胞裂解液， 裂解结束后加入PBS液， 用移液管吹打混匀， 并再次滤过200目金属网， 取出10 μL进行台盼蓝拒染法计数细胞， 拒染率&>95%， 用PBS洗2遍， 之后配成密度为1×1010/L的细胞悬液。取小鼠脾脏， 将脾脏置于200目金属网中用剪子剪成小块， 用5 mL注射器芯轻轻研磨， 制成脾细胞悬液， 之后方法同上。

　　1.2.2 αGalCer负载于PECD1d四聚体 将αGalCer溶于1 000 mL/L的DMSO中， 配成浓度为0.1 g/L; 之后震荡αGalCer液， 37℃， 12 h; 用之前超声水浴37℃， 10 min; 取10.4 μL的上述αGalCer液加入到100 μL的四聚体溶液中; 将上述二者的混合液37℃， 避光， 孵育24～48 h， 即成αGalCer PECD1d四聚体。4℃避光保存。

　　1.2.3 二色荧光标记 取100 μL的骨髓单个核细胞悬液或脾脏单个核细胞悬液， 加入PECY5、 PE 同型阴性对照各2.5 μL; AntiCD3ePECY5 2.5 μL、 负载αGalCer的CD1d四聚体PE 2 μL。4℃避光孵育35 min， 之后加PBS液3 mL， 1 700 r/min， 离心5 min， 弃上清， 同法应用PBS共洗2遍， 加0.5～1 mL PBS液悬浮细胞， 待机检测。

　　1.2.4 FCM分析 所有样品用Beckman Coulter FCM进行分析， 激发光为488 nm 激光， 前向散射(FSC) 和侧向散射(SSC) 以线性信号收集。先在FSCSSC 散点图上划出淋巴细胞区， 然后检测淋巴细胞上的PECY5及PE的荧光强度， 其中重叠荧光在每次测定前以荧光微球标准补偿进行消除， 测定时各荧光通道均以相应同种型(isotype) IgG染色细胞作阴性对照［4］。

　　2 结果

　　2.1 小鼠脾脏单个核细胞及骨髓单个核细胞的FSCSSC 二维点图 以FSC为X轴， SSC为Y轴， 右下方密集区， 与其他细胞群有明显的分界， 为淋巴细胞区。

　　2.2 正常小鼠脾脏及骨髓中的NKT细胞 （CD3+CD1d四聚体）的比例（分别为1.3%和1.6%， 图1）， 左侧图形为同型阴性对照， 右侧图形为CD3、 CD1d四聚体双标。

　　图1 正常小鼠脾脏及骨髓中的NKT细胞（略）

　　2.3 腹腔注射αGalCer小鼠的脾脏中NKT细胞的比例 腹腔注射αGalCer 5 μg/次第3天小鼠的脾脏中NKT细胞的比例 （2只小鼠注射αGalCer后脾脏NKT细胞的比例分别为2.7%和2%， 图2）左侧图形为同型阴性对照， 右侧图形为CD3、 CD1d四聚体双标。

　　图2 腹腔注射αGalCer小鼠的脾脏中NKT细胞的比例（略）

　　3 讨论
　　
　　造血干细胞移植是治疗血液系统恶性肿瘤、 骨髓衰竭及某些实体瘤的最有效方法， 但伴发的严重的并发症移植物抗宿主病由于其较高的发病率及死亡率限制了造血干细胞移植的广泛应用。调节型细胞是一群具有诱导同种反应性T细胞失能或抑制活性的细胞。目前研究认为: NKT细胞、 CD4+CD25+T细胞、 CD4+CD25-IL10+Tr细胞、 γδT细胞、 DN-T细胞及调节性DC 均为调节型细胞［5］。NKT细胞具有抗肿瘤及诱导移植耐受的双重作用， 是一种非常有应用潜能的调节型细胞。过去由于检测NKT细胞工具的缺乏而限制了对其的研究。自从CD1d四聚体的出现， 大大加速了对NKT细胞的研究。
　　
　　本研究中， 我们首先将αGalCer负载于空的CD1d四聚体上， 实验步骤简便， 易于操作， 构建成的αGalCer/CD1d四聚体可避光储存于4℃， 随时备用。在检测小鼠的脾脏及骨髓中的NKT细胞时， 先制备脾脏及骨髓的单个核细胞， 之后在FSCSSC 散点图上划出淋巴细胞区。淋巴细胞区与其他细胞群分界是否清楚与溶血的效果、 FCM分析时FSC及SSC电压、 增益的调节明显相关， 脾脏及骨髓单个核细胞的淋巴细胞群分界均较好， 为之后的淋巴细胞区的圈定而进一步标定NKT细胞提供参考。研究中双标CD3及αGalCer/CD1d四聚体， 将共表达CD3及αGalCer/CD1d四聚体的细胞记为NKT细胞。检测了正常小鼠脾脏及骨髓中NKT细胞占淋巴细胞的比例分别为1.2%和1.4%， 并检测了腹腔注射αGalCer 5 μg后第3天小鼠的脾脏中NKT细胞的比例为2%和2.7%， 与文献报道相似［3， 6］。双标CD3及αGalCer/CD1d四聚体组与同型阴性对照组相比双阳性区明显阳性。
　　
　　αGalCer/CD1d四聚体是目前国际公认的检测小鼠NKT细胞的金标准方法。本研究表明αGalCer较易成功负载于PECD1d四聚体， 双标αGalCer/CD1d四聚体及CD3可用于方便的检测小鼠脾脏、 骨髓等的NKT细胞。

参考文献

　　［1］ Godfrey DI， Macdonald HR， Kronenberg M， et al. NKT cells: what’s in a name? ［J］. Nat Rev Immunol， 2004， 4(3): 231-237.

　　［2］ Watarai H， Nakagawa R， OmoriMiyake M， et al. Methods for detection， isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells［J］. Nat protocols， 2008， 1(3): 70-78.

　　［3］ Ikarashi Y， Akira Iizuka A， Heike Y， et al. Cytokine production and migration of in vitroexpanded NK1.1-invariant Vα14 natural killer T (Vα14i NKT) cells using αgalactosylceramide and IL2［J］. Immunol Lett， 2005， 101(2): 160-167.

　　［4］ 万建责力， 曾耀英 ， 何贤辉， 等. 正常人外周血TCRVα24+NKT 细胞体外活化特性观察［J］. 中国病理生理杂志， 2002 ， 18(7): 774-777.

　　［5］ Sun Y， Tawara I， Toubai1 T， et al. Pathophysiology of acute graftvshost disease: recent advances［J］. Transl Res， 2007， 150(4): 197-214.

　　［6］ 刘景华， 于 力. NKT细胞研究进展［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2008， 24(2): 194-196.