SU11248干预白血病细胞HL60对P27KIP1和cyclin G蛋白表达的影响

　　 作者：林东红， 韩燕燕， 陈惠瑜， 罗玲清， 胡建达

【摘要】 目的: 探讨SU11248对人髓系白血病细胞株HL60的效应及其对HL60细胞表达P27KIP1和cyclin G蛋白改变的影响。方法: 应用MTT法检测SU11248对HL60细胞增殖能力的影响; 采用Western blot检测SU11248干预HL60细胞前后P27KIP1和cyclinG蛋白表达水平的变化及其相关性。结果: 不同浓度（0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 mg/L）SU11248作用HL60细胞24 h、 48 h、 72 h、 96 h后， SU11248可抑制HL60细胞增殖， 抑制作用呈现剂量和时间依赖性， 半数抑制浓度（IC50）约为2.0 mg/L。2.0 mg/L SU11248作用HL60细胞72 h时抑制率达到最高。2.0 mg/L SU11248作用HL60细胞后cyclinG蛋白表达呈时间依赖性降低， 而P27KIP1蛋白表达呈时间依赖性升高。两蛋白各时间组的改变与对照组相比差异均有统计学意义（P&<0.05）。结论: SU11248具有抑制HL60细胞增殖的生物效应， 在HL60细胞及SU11248干预HL60细胞过程中， P27KIP1 基因可能对cyclinG基因及细胞周期发挥负性调控作用。SU11248通过上P27KIP1、 下调cyclin G而干扰细胞周期可能是其发挥抑制肿瘤细胞分裂的环节之一。

【关键词】 SU11248; HL60细胞; P27KIP1; cyclinG

造血细胞周期调控异常是白血病发生过程中最重要的事件之一。参与细胞周期调控的因子主要有细胞周期蛋白（cyclins）、 细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinases， CDK）、 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（cyclindependent kinases inhibitor， CKI）。在多种cyclin中， cyclinG在细胞周期家族中发现较晚， 其功能可能为在细胞周期调控和DNA修复中起作用， 并参与细胞凋亡过程。有资料报道［1］， 在某些肿瘤中， cyclinG的过表达有促进细胞周期的作用， 可促进细胞增殖及癌细胞生长过程， 在肿瘤的生物靶向治疗方面有很好的应用前景。有研究初步发现cyclin G与急性淋巴细胞白血病、 慢性粒细胞白血病等恶性血液病有关［2］。

　　CKI的Kip家族包括p21、 p27、 p57。其中P27KIP1为新近发现的广谱的CKI， 能抑制大多数cyclinCDK的磷酸化激酶活性， 是细胞转录的负性调控因素， 在实验性肿瘤的发生发展过程中被证实是一种抑制癌基因［3］。其低表达或不表达与白血病患者病情进展及预后相关［4］。在白血病的研究中， 发现某些cyclin的表达与CKI的表达之间存在着正反馈机制［5］， P27KIP1为广谱的CKI， 其与cyclin G 之间也可能存在互调控关系。

　　苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate， Sutent， SU 11248)是一种新的多靶点酪氨酸激酶抑制剂， 具有抗肿瘤和抗血管生成的双重作用。2006年1月FDA批准本品用于甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate， GGleevec)治疗失败或不能耐受的胃肠道间质瘤患者以及晚期肾细胞癌患者［6， 7］， 对其他实体瘤的治疗应用也已进入II期临床阶段， 但其与恶性血液病关系的研究尚不多。因此， 我们拟以人髓系白血病细胞株HL 60为白血病模型， 探讨白血病细胞HL60 P27KIP1与cyclin G蛋白的表达及SU11248干预对蛋白表达的影响， 为白血病的生物靶向治疗提供新途径。

1 材料和方法

　　1.1 材料 SU11248 购自biocompound公司。用二甲亚砜溶解， -20℃避光保存备用。人髓系白血病细胞株HL60由福建省血液病研究所传代保存。RPMI1640培养液为Gibco公司产品; 二甲亚砜、 MTT溶液为Sigma公司产品; Protein Extraction Reagent 为Pierce公司产品; P27KIP1多克隆抗体（兔抗人）为eBioscience公司产品; cyclin G1多克隆抗体（兔抗人）为LAB VISION公司产品; βactin单克隆抗体（大鼠抗人）、 Western blot Luminol Reagent为Santa Cruz公司产品; βactin蛋白、 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG及山羊抗大鼠IgG、 硝酸纤维膜(NC膜)购于北京中山生物技术公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 建立细胞培养体系 HL60细胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 于37℃、 50 mL/L CO2， 饱和湿度条件下培养， 2 d传代1次， 培养中的细胞密度均保持在(1.0～5.0)×108/L， 取对数生长期细胞作为实验用细胞。

　　1.2.2 MTT法检测SU11248对HL60细胞的干预作用 取对数生长期细胞， 将密度调整为1.0×108/L， 分别与终浓度为0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 mg/L的SU11248共培养， 以未处理的HL60细胞为对照， 分别接种于96孔板， 每孔200 μL， 每组设4个平行孔， 置37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下进行细胞培养， 分别于24 h、 48 h、 72 h、 96 h加入5 g/L的MTT溶液20 μL/孔， 继续培养4 h后离心去上清， 加入终止液DMSO溶液150 μL/孔， 振荡10 min， 在酶标仪上用双波长492 nm和630 nm测吸光值（A值）， 以吸光值为纵轴， 作用时间为横轴绘制细胞增殖曲线。取48 h的A值比较各组的细胞增殖抑制率， 细胞增殖抑制率=（1-用药组平均A值）/对照组平均A值×100%， 实验重复3次， 取均值。计算IC50(半数抑制浓度)。

　　1.2.3 Western blot 检测P27KIP1和cyclinG蛋白水平的变化 以IC50（2.0 mg/L）的SU11248作用HL60细胞后， 于24 h、 48 h、 72 h分别提取蛋白， 以βactin蛋白为内参， 进行Western blot检测， 简述如下: 收集对照组和2.0 mg/L的SU11248作用24 h、 48 h、 72 h后的HL60细胞， 每组约5×109/L个， 用预冷PBS洗2次， 去上清。按1×106细胞/100 μL裂解液+1 U蛋白酶抑制剂的比例裂解细胞， 提取细胞总蛋白。Bradford 法测定蛋白浓度， 20 μg总蛋白进行120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳， 电转移至NC膜上， 用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h。根据蛋白Marker， 将膜在适当的位置剪开， 做好标记， 分别与相应的一抗(1∶100兔抗人P27KIP1抗体、 1∶200兔抗人cyclin G1抗体、 1∶1 000鼠抗人βactin抗体)反应过夜。再与相应二抗(1∶2 000山羊抗兔IgG及1∶5 000山羊抗大鼠IgG)室温下反应1 h， ECL免疫印迹化学发光试剂放射自显影， 应用计算机图像扫描分析系统对图像进行扫描分析， 以目的条带与内参照βactin的灰度值之比作为目的条带蛋白的相对表达量。实验重复4次。

　　1.2.4 统计学分析 采用SPSS11.0统计软件对所有数据进行统计学分析， 多组间均数比较采用方差分析， 均数间两两比较用Dunnettt检验， 组间率的比较采用χ2检验， 实验结果用x±s表示， 以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MTT法检测SU11248对HL60细胞增殖的影响

　　2.1.1 不同浓度SU11248对HL60细胞的增殖抑制作用 MTT实验显示， 不同浓度SU11248作用HL60细胞24 h、 48 h、 72 h、 96 h后， 细胞增殖反应均较对照组减低（表1）， 生长曲线渐趋平缓。SU11248对HL60细胞的抑制率随药物浓度的加大而增加， 各浓度组与对照组相比差异有统计学意义（P&<0.05)， 并且随作用的时间延长而增加。SU11248作用HL60细胞48 h后， SU11248 为0.5、 1.0、 2.0、 4.0、 8.0 mg/L处理组对HL60细胞生长的抑制率分别为24.0%、 33.0%、 41.8%、 72.2%、 92.5%。根据正规机率单位法计算得IC50(半数抑制浓度)约为2.0 mg/L。表1 SU11248对HL60细胞生长的影响

　　2.1.2 SU11248对HL60细胞增殖抑制作用的时效关系 2.0 mg/L的SU11248作用HL60细胞24 h、 48 h、 72 h、 96 h后， 各时间段的HL60细胞均受不同程度的抑制， 在72 h时抑制率达到最高， 结果见表2。表2 SU11248（2.0 mg/L）作用HL60细胞不同时间后的抑制率

　　2.2 Western blot检测SU11248干预HL60细胞前后P27KIP1和cyclinG蛋白表达水平的变化 2.0 mg/L SU11248作用HL60细胞24 h、 48 h、 72 h后， 与对照组相比， cyclinG蛋白表达水平明显降低， 且随着处理时间的延长表达水平逐渐降低(P&<0.05); 而P27KIP1蛋白的表达水平升高， 且随着处理时间的延长， 表达水平逐渐增高(P&<0.05， 图1、 表3)。表3 各时间组HL60细胞P27KIP1和cyclinG蛋白表达分析（n=4， x±s）

3 讨论

　　继续深入研究细胞毒性药物， 逐渐开发和引入分子靶向性药物， 是21世纪后抗肿瘤药物研发的重要战略。从细胞受体与增殖调控的分子水平研究肿瘤发生机制、 以相应分子为靶点的药物研发和临床治疗成为目前研究的热点。

　　SU11248是一种口服的小分子药物， 能够抑制VEGFR2、 R3和R1以及 PDGFRβ、 KIT、 FLT3和RET的酪氨酸激酶活性， 通过特异性阻断这些信号传导途径达到抗肿瘤效应。因其抗肿瘤活性在各种晚期恶性肿瘤治疗中得到证实而倍受关注。国外有实验初步表明SU11248可以诱导急性髓细胞白血病患者部分缓解［8］。

　　为探讨SU11248对白血病细胞的可能作用， 探讨SU11248干预前后人髓系白血病细胞株HL60细胞P27 KIP1和cyclin G蛋白表达及其相关性， 为SU11248在白血病的治疗研究及分子靶向治疗提供实验依据， 本实验观察不同剂量SU11248作用HL60细胞不同时间后对细胞增殖的影响， 并检测cyclin G及其负调控因子P27KIP1蛋白表达的变化。结果显示: SU11248对HL60细胞增殖具有较强的抑制作用， 此抑制作用具有明显的量效和时效关系。SU11248作用HL60 的IC50约为2.0 mg/L。

　　SU11248抑制HL60细胞增殖过程中， HL60细胞P27KIP1蛋白表达较对照组(干预前)高， 且随着作用时间的延长而逐渐上调。而cyclinG 蛋白的表达水平较对照组(干预前)下降， 并且随时间的延长下调越明显， 此结果与本课题的前期实验结果相吻合， 即大多数的白血病患者 cyclinG mRNA水平较高， 临床上缓解后cyclinG mRNA水平下调， cyclinG mRNA高水平患者预后较差［9］。另经分析显示， 在HL60细胞及SU11248干预HL60细胞的过程中， P27KIP1 蛋白的表达水平与cyclinG蛋白表达水平成负相关关系。国外有研究报道， P27 KIP1作为一种非特异性CKI， 能抑制多种cyclinCDKS， 限制性调控细胞周期进程， 使细胞周期阻滞在G1期， 是G1期进程的重要负调控因子。因此推测: 在白血病细胞HL60中P27KIP1基因作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子， 其编码的P27KIP1蛋白负调控cyclinGCDK等的活性， 抑制细胞从G1期进入S期， 从而抑制细胞增殖。SU11248可能通过上调P27KIP1、 下调cyclin G（可能还有其它相关基因）的表达使HL60细胞阻滞于G0/G1期， 阻止其进入S期和G2/M期， 导致细胞无法完成DNA合成， 干扰了蛋白质代谢， 从而抑制了细胞分裂。有关P27KIP1基因的功能还不仅如此， 有研究表明， P27KIP1的超表达能诱导细胞凋亡［10］。因此， 无论是cyclin G还是P27KIP1 可能都是复杂分子调控网络中的一员， SU11248对白血病细胞的增殖及凋亡影响也具有其错综复杂性， 这些都有待于进一步研究和探索。

参考文献

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