METT11D1抗体的制备与鉴定

　　　　 作者：赵静， 丁丽华， 甘纯玑， 李杰之， 叶棋浓

【摘要】 　　目的: 制备METT11D1(methyltransferase 11 domain containing 1.简称其为GA9)（GenBank: AK024512）的多克隆抗体， 并对其特异性进行鉴定。方法: 融合表达GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）蛋白， 利用包涵体纯化蛋白方法纯化蛋白， 常规免疫小鼠， 制备多克隆抗体。利用转染带有FLAG标签的FLAGGA9真核表达载体的293T细胞裂解物， Western blot检测抗体的特异性。结果: 获得了GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）融合蛋白; 利用这些融合蛋白得到的多克隆抗体可特异识别FLAGGA9蛋白。结论: 成功得到可特异识别GA9的多克隆抗体， 为进一步研究GA9的功能奠定了坚实的基础。

【关键词】 GA9; 多克隆抗体

　　在雌激素受体(estrogen receptor， ER)的信号通路中， ER并不是单独发挥作用的， 而是要与多种蛋白质发生相互作用， 并受到这些蛋白质的影响， 进而引起下游基因表达的变化， 发挥其生物学功能， 这是一个动态平衡的过程。与ER结合的蛋白质被统称为ER共调节因子， 当机体中的这些蛋白质发生异常表达时， 就会通过与ER的相互作用导致下游基因表达的异常， 从而引起癌症的发生［1］。GA9可能就是这样一种蛋白， 它是以ER作诱饵通过酵母双杂交从乳腺cDNA文库中钓取的基因， 编码456个氨基酸（GenBank AK024512）。本实验中构建了GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）融合蛋白表达载体， 从包涵体中纯化了GSTGA9(1228aa)和GSTGA9(229456aa)两种融合蛋白， 并将其免疫小鼠， 获得可识别GA9蛋白的特异性抗体， 为进一步研究GA9在乳腺癌中的功能提供了条件。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　克隆载体pGEXKG、E.coli DH5α、FLAGGA9均为本实验室保存。293T细胞为本实验室保存， 采用含100 mL/L胎牛血清(江海生物工程有限公司)的DMEM培养基(Invitrogen公司)于37℃、 50mL/LCO2培养箱内常规培养。转染试剂Vigofect购自威格拉斯公司。抗FLAG单克隆抗体(mAb)购自Sigma公司， HRP标记的羊抗鼠IgG购自Vector公司。限制性内切酶购自NEB公司， 高保真pfu DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶购自Promega公司， 质粒提取试剂盒(包括小量提取和大量制备2种)购自Qiagen公司， DNA胶回收试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自Promega公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组质粒的构建

　　分别以表1中所列的引物， 以pcDNA3FLAGGA9为模板， PCR扩增GA9(1228aa)和GA9(229456aa)编码序列， 双酶切PCR产物， 将PCR产物分别插入到同样双酶切的pGEXKG载体中， 即得重组质粒。PCR扩增条件为: 94℃变性1 min后， 按以下参数进行29次循环: 94℃变性1 min， 55℃复性1 min， 72℃延伸2 min， 最后72℃延伸7 min。PCR扩增所用酶为目前保真度最高的pfu DNA聚合酶。表1 扩增GA9的引物及酶切位点（略）

　　1.2.2 GA9融合蛋白的表达鉴定

　　将含pGEXKG空载体、pGSTGA9(1228aa)和pGSTGA9(229456aa)的DH5α以0.5％～1％转接到5 mL LB培养基中， 30℃培养到A=0.4～0.6时加入IPTG(0.5 mmol/L)， 30℃培养4～5 h， 收菌， 进行考马斯亮蓝染色和Western blot检测［2］。

　　1.2.3 多克隆抗体的制备

　　将含pGSTGA9(1228aa)和pGSTGA9(229456aa) DH5α以0.5％～1％转接到培养瓶中， 扩大培养， 30℃培养到A=0.4～0.6加入IPTG(0.5 mmol/L)， 30 ℃培养4～5 h， 收菌， 超声破碎， 收集包涵体， 利用尿素洗去杂蛋白。将纯化后的GSTGA9(1228aa)和GSTGA9(229456aa)包涵体蛋白与福氏完全佐剂1∶1混匀后， 皮下多点注射BALB/c小鼠， 初次免疫后每2周加强免疫1次， 末次免疫后第7天眼球取血， 免疫血清于-70℃保存［2］。

　　1.2.4 哺乳动物细胞的转染

　　用DMEM培养基(含100 mL/L FBS)将293T细胞接种在6孔板中。接种后24 h， 将总量为5 μg DNA与100 μL NaCl混合， 再将2 μL Vigofect与100 μL NaCl混合， 然后将上述两种溶液混合， 室温放置20 min， 加入到细胞中， 4 h后换液。

　　1.2.5 Western blot 检测

　　融合蛋白表达鉴定时， 将诱导表达后的细菌收集， 加入SDS加样缓冲液， 煮沸10 min， 离心后取上清液进行SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上， 用HRPGST抗体进行Western blot检测。在硝酸纤维素膜上加入50 g/L脱脂奶粉稀释的HRPGST抗体， 室温轻摇1 h， TBST洗3次， 每次7 min， 化学发光法显色5 min， 压片显影。
　　
　　多克隆抗体鉴定时， 293T细胞转染24 h后， 收集细胞， 加入SDS 加样缓冲液， 煮沸10 min， 离心后取上清液进行SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上， 分别用制备的免疫血清和FLAG抗体检测。用FLAG抗体检测的步骤同上。用免疫血清进行Western blot检测时， 用100 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜， 加入1∶1 000稀释的免疫血清， 室温轻摇1 h， TBST洗3次， 每次7 min， 加入用50 g/L脱脂奶粉稀释的HRP羊抗鼠IgG， 室温轻摇1 h， TBST洗3次， 每次7 min， 化学发光法显色5 min， 压片显影。

　　2　结果

　　2.1 重组质粒的构建与鉴定

　　分别用表1中的限制性内切酶双酶切重组质粒pGSTGA9(1228aa)和pGSTGA9（229456aa）及空载体pGEXKG， 得到了与预期大小相符的外源基因插入片段(图1)， 而对照空载体经双酶切后无此插入片段， 说明克隆已经成功。重组质粒经序列测定证明， 编码区序列完全正确（数据略）。

　　2.2 蛋白在大肠杆菌中的表达

　　将pGEXKG空载体及pGSTGA9(1228aa)和pGSTGA9（229456aa）融合表达载体转化入E.coli DH5α 中诱导表达， 经考马斯亮蓝染色鉴定（图2A）和用GST抗体进行Western blot分析表明（图2B）， GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）融合蛋白获得正确表达。

　　2.3 GSTGA9融合蛋白的纯化

　　利用包涵体纯化方法纯化后的蛋白经考马斯亮蓝染色鉴定（图3A）和Western blot分析（图3B）得到大量的纯度较高的GSTGA9（1228aa）和GSTGA9（229456aa）融合蛋白。

　　2.4 GA9在哺乳动物细胞中的表达及多克隆抗体的鉴定

　　为便于GA9抗体特异性的验证， 将空载体pcDNA3FLAG和pcDNA3FLAGGA9重组质粒分别转染293T细胞， 收集细胞总蛋白质进行SDSPAGE， 用FLAG抗体进行Western blot分析。结果表明， pcDNA3FLAGGA9在真核细胞中表达了相对分子质量(Mr)约为55 000的蛋白质， 而空载体无蛋白质条带， 与预期结果相同(图4A)。用制备的免疫血清进行Western blot分析， 结果表明， 转染FLAGGA9重组质粒的293T细胞中均可检测到Mr正确的蛋白条带， 且条带位置与用FLAG抗体检测的条带位置相同， 而转染空载体的293T细胞中未检测到任何条带(图4B、 C)。这些结果说明制备的多克隆抗体能特异地与GA9蛋白反应。

　　3 讨论

　　每年全世界每一百万新病例中， 乳腺癌是其中发病率较高的恶性肿瘤， 占女性肿瘤的18%［3］。在我国， 乳腺癌是十大恶性肿瘤之一， 其发病率呈低龄化和逐年上升趋势［4］， 已经严重威胁妇女的健康。雌激素(estrogen， E) 在乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要作用， 通过与ER结合从而激活含雌激素应答元件(estrogen response element， ERE)的基因， 影响下游靶基因的转录、 翻译和表达水平［5］， 进而影响细胞的增殖与分化。
　　
　　GA9可能是一种ER共调节因子， 为了进一步研究它的生物学功能， 我们利用GSTGA9(1228aa)和GSTGA9(229456aa)包涵体蛋白， 经多次尿素洗脱杂蛋白后， 免疫小鼠成功地制备了特异性好的抗GA9的抗体， 从以上结果显示， 利用GSTGA9(229456aa)制备的抗体免疫效果较好， 而利用GSTGA9(1228aa)制备的抗体免疫效果相对较差， 但两抗体的特异性都很好。将pcDNA3FLAGGA9与空载体pcDNA3FLAG分别转染293T细胞后， 用自制的抗体进行Western blot分析表明， 转染空载体的293T细胞中并未检测到条带， 而转染pcDNA3FLAGGA9的293T细胞中则检测到与用FLAG抗体检测的条带位置相同的条带， 说明制备的该多克隆抗体可以特异地与GA9蛋白反应。该抗体的成功制备为下面工作的展开提供了重要的条件， 为今后研究GA9的内源性表达分布、 功能区域定位、 与其他蛋白质间相互作用、 与乳腺癌发生关系等奠定了基础。

参考文献

　　［1］Klinge CM. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements［J］. Nucleic Acids Research， 2001， 29(14): 2905-2919.

　　［2］丁丽华， 袁斌， 严景华， 等. FHL1抗体的制备与鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22（6）: 804-806.

　　［3］Bershtein LM， Poroshina TE， Zimarina TS， et al. Expression of estrogen receptoralpha and beta in primary breast neoplasms and tumors exposed to neoadjuvant hormonal therapy［J］. Bull Exp Biol Med， 2004， 138(5): 494-496.

　　［4］Aranda A， Pascual A. Nuclear hormone receptors and gene expression［J］. Physiol Rev， 2001， 81(3): 1269-1304.

　　［5］Nilsson S， Gustrafsson JA. Estrogen receptor transcription and transactivation basic: aspects of estrogen action［J］. Breast Cancer Res， 2000， 2(5): 360-366.