大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

【摘要】 　　目的: 构建大鼠CD36真核表达载体， 并在293T细胞中表达。方法: 应用RTPCR技术， 从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中， 获得CD36基因编码序列片段， 克隆至真核表达载体pEGFPN1中， 对重组质粒进行酶切和测序鉴定后， 以脂质体介导法转染至293T细胞， 通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果: 酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFPN1CD36构建成功， 荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达。结论: 成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFPN1CD36， 并在293T细胞中过表达。

【关键词】 CD36; 真核表达载体; 293T细胞; 表达

　　CD36是一种相对分子质量（Mr）为88 000的细胞表面单链糖蛋白， 属于B 类清道夫受体， 在体内血小板、 内皮细胞以及巨噬细胞等多种细胞表面表达， 因其能与多种配体结合而具有复杂的生物学功能［1］。CD36是血小板反应素1（trombospondin1， TSP1）的受体， 通过与TSP1在细胞表面发生特异性结合参与转化生长因子β1（transforming growth factorβ1， TGFβ1）的活化、 介导TSP1抗血管生成作用， 在纤维化、 抗血管生成、 肿瘤免疫等方面有重要作用［1］。国内外研究表明， CD36与TSP1特异性结合是TGFβ1活化过程中的关键环节， 而TGFβ1又与肺纤维化的发生发展密切相关［2， 3］。在本实验中， 我们克隆了大鼠CD36基因， 并构建其真核表达载体， 为进一步研究其功能奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒pEGFPN1购自Clontech公司， 大肠杆菌DH5α购自Amersham biosciences公司， 293T细胞购自中科院细胞库， NR8383细胞购自ATCC细胞库。TRIzol试剂、 Lipofectamine2000购自Invitrogen公司; RTPCR Kit购自promega公司; Taq DNA聚合酶和蛋白质Marker标准均购自大连宝生物工程有限公司 (TaKaRa公司); 限制性内切酶Xho Ⅰ、 Kpn Ⅰ、 T4 DNA连接酶购自NEB公司; DNA Marker标准购自上海捷瑞生物工程有限公司; 质粒抽提试剂盒购自QIAGEN公司; 凝胶纯化回收试剂盒购自北京天根科技生化有限公司; 羊抗大鼠CD36抗体和兔抗羊二抗购自Santa公司; ECL化学发光试剂盒购自Amersham biosciences公司; 其余一般化学试剂均为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank的大鼠CD36基因的序列（序列号为: NM_031561）设计合成引物， 引物序列为: 上游引物: 5′CCGCTCGAGATGGGCTGCGATCGGAAC3′， 下游引物: 5′GGGGTACCGTTTTTCCATTCTTAGATCTGCAAG3′， 引物5′端分别加入XhoⅠ和KpnⅠ酶切位点(框线内部分)。引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

　　1.2.2 总RNA提取及RTPCR扩增 采用TRIzol一步法依照说明书提取NR8383细胞中的总RNA。取2 μg的RNA用MMLV反转录酶反转录成cDNA， 以此为模板， 进行PCR扩增CD36基因。反应体系: 10×buffer 2 μL， 2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL， 引物各0.4 μL， 5 U/μL Taq酶0.2 μL， ddh3O 15.2 μL， 模板1 μL， 计20 μL反应体系。扩增条件: 94℃ 30 s变性， 94℃ 30 s变性， 55℃ 30 s退火， 72℃ 1.5 min延伸; 循环30次; 最后72℃延伸6 min。PCR扩增产物电泳后， 回收目的片段。

　　1.2.3 pEGFPN1CD36重组质粒的构建与鉴定 用XhoⅠ、 KpnⅠ分别酶切pEGFPN1和CD36基因片段， DNA凝胶回收试剂盒回收酶切片段。将回收片段按目的基因和载体浓度为1∶1， 反应体系10 μL， 在T4连接酶作用下4℃连接12 h， 转化DH5α感受态菌。经卡那霉素筛选， 挑取阳性克隆菌落， 摇菌提取质粒， 进行XhoⅠ、 KpnⅠ双酶切鉴定， 酶切鉴定正确的克隆送上海吉凯基因化学技术有限公司进行DNA测序， 将完全正确的质粒命名为pEGFPN1CD36。

　　1.2.4 pEGFPN1CD36重组质粒转染293T细胞 293T细胞用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM培养， 转染前24 h传代， 接种入24孔板中， 每孔2×105个细胞， 待每孔细胞密度达到70%～80%时按Lipofectamine2000操作说明书进行质粒转染。培养48 h后， 荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况并收获细胞。

　　1.2.5 Western blot检测 将上述收获的细胞用冰PBS洗涤， 加入蛋白裂解液裂解， 4℃下12 000 g离心10 min， 取上清分装， 取适量稀释后进行蛋白定量。用上样缓冲液将各样品蛋白稀释至相同浓度， 100℃水浴5 min， 然后行SDSPAGE分析。电转移至PVDF膜上， 50 g/L脱脂奶粉室温振荡封闭1 h， 与1∶200稀释后的一抗4℃孵育过夜， PBST洗膜3次， 然后与1∶5 000稀释后二抗室温孵育2 h， ECL化学发光显色， X光片显影。

　　2 结果

　　2.1 CD36基因的RTPCR扩增 以总RNA为模板oligod（T）进行反转录， 以 CD36基因的上下游引物进行PCR扩增， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析得到约1 500 bp的条带， 与预期大小（1 436 bp）一致 (图1)。

　　图1 CD36基因RTPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳（略）

　　M: DNA marker;　　1: CD36 PCR扩增产物.

　　2.2 重组质粒pEGFPN1CD36的构建与鉴定 重组质粒pEGFPN1CD36经XhoⅠ、 KpnⅠ双酶切后， 出现2条片段， 即1 425 bp和4 695 bp， 酶切片段大小与预期值相符(图2)。DNA测序结果亦显示， 已成功将CD36基因片段插入pEGFPN1质粒中， 其编码序列与GenBank的大鼠CD36基因的序列相符。

　　图2 重组质粒pEGFPN1CD36的双酶切鉴定（略）

　　M: DNA marker;　　1: 重组质粒 pEGFPN1CD36; 2: XhoⅠ和KpnⅠ双酶切的重组质粒.

　　2.3 荧光镜检pEGFPN1CD36质粒在293T细胞中的表达 转染48 h后， 荧光显微镜下观察， 在转染空质粒pEGFPN1的293T细胞中可见绿色荧光在胞质表达(图3A)， 在转染重组质粒pEGFPN1CD36的293T细胞中可见绿色荧光在胞膜表达(图3B)。

　　2.4 Western blot分析 Western blot结果显示， 在转染重组质粒pEGFPN1CD36的293T细胞中检测到蛋白Mr大小为115 000的蛋白条带， 而在转染空质粒的293T细胞中未检测到CD36GFP融合蛋白 (图4)。

　　图3 pEGFPN1CD36 在293T细胞中表达的荧光检测（×200）（略）

　　A: 293T细胞/pEGFPN1; B: 293T细胞/pEGFPN1CD36.
　
　　图4 转染的293T细胞中CD36GFP融合蛋白的表达（略）

　　1: 293T细胞/pEGFPN1; 2: 293T细胞/pEGFPN1CD36.

　　3 讨论
　　
　　肺纤维化是一组由多种病因所引起的肺破坏性疾病， 但目前对肺纤维化发病的分子机制还不十分明了。国内外研究表明， 细胞因子在纤维化性疾病的发生发展过程中起着非常重要的作用， 特别是TGFβ1， 被认为是关键的致纤维化因子， 是迄今发现的最强的细胞外基质沉积促进剂［4］。而其他细胞因子， 如IFNγ、 IL1、 IL7、 IL4及IL13等， 只是通过促进或抑制TGFβ1的信号转导， 来调控胶原蛋白的产生［5-7］。目前已清楚， 只有活化形式的TGFβ1才能与其受体结合发挥致纤维化作用， 而其在体内首先以潜在非活化的潜在TGFβ1（latent TGFβ1， LTGFβ1）形式分泌。这种LTGFβ1是由潜在联系多肽（latencyassociated peptide， LAP）和TGFβ1组成的蛋白复合物， 该复合物不能结合TGFβ1受体并激活下游信号。CD36作为TSP1的受体， 在TGFβ1活化过程中的发挥重要作用。首先LTGFβ1中的LAP与TSP1 Ⅰ型重复序列上TSR1和TSR2之间的KRFK氨基酸序列特异结合， 形成TSP1/LTGFβ1蛋白复合物， 当该蛋白复合物再通过TSP1分子中TSR2和TSR3基序中CSVTCG氨基酸序列与CD36外功能区第93110位YRVRFLAKENVTQDAEDN氨基酸序列特异结合而发生空间构象变化， 邻近的纤溶酶才能作用于该蛋白复合物使TGFβ1与LAP发生分离， 从而产生活化的TGFβ1［8， 9］。
　　
　　本研究成功地构建大鼠CD36真核表达载体， 并转染至293T细胞， 通过荧光显微镜观察和Western blot方法检测其在293T细胞的胞膜上表达， 为进一步实验奠定实验基础。

参考文献

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