CD4+CD25+调节性T细胞与自身免疫性肝病研究进展

【关键词】 CD4+CD25+调节性T细胞; 自身免疫性肝病; 免疫耐受

　　调节性T细胞（regulatory T cell， Tregs）是体内具有免疫抑制功能的异质性细胞群， 对维持免疫系统稳态起重要作用。特别是CD4+CD25+调节性T细胞在维持外周免疫耐受中起重要作用， 其数量减少或功能缺失可导致自身免疫病的发生。肝脏在生理和某些病理情况下处于免疫耐受状态， 一旦天然免疫耐受状态被打破， 发生针对肝组织抗原的免疫应答及异常自身反应， 造成靶组织损伤和炎症， 便会发生自身免疫性肝病。近些年， 人们对CD4+CD25+调节性T细胞维持免疫耐受的机制及在自身免疫性肝病中的作用进行了初步研究， 现就有关领域的研究进展作一综述。

　　1 CD4+CD25+调节性T细胞概述

　　调节性T细胞是指既可天然产生又可以经诱导而产生的具有免疫抑制功能的细胞群， 包括Th3、Tr1和CD4+CD25+Tregs。天然调节性T细胞即CD4+CD25+Tregs， 占人和小鼠外周血CD4+T细胞5%～10%［1］， 其表达的表面分子包括CD4、CD25（IL2Rα链）、叉头样转录因子Foxp3（foxhead box protein 3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor， GITR）、转化生长因子β（transforming growth factor， TGFβ）、PD1（programmed death1）、趋化因子受体CCR4、Toll样受体（tolllike receptor， TLR）、 淋巴细胞抗原复合体6(Ly6)、Neuropilin1及归巢受体CD103等， 这些表面分子对CD4+CD25+Tregs的发育及功能活化起着重要作用［2］。CD4+CD25+Tregs通过细胞接触依赖方式和（或）分泌可溶性细胞因子， 如IL6、IL10和TGFβ对效应细胞发挥免疫抑制功能［3］， 在免疫病理、移植物耐受、防止自身免疫反应和维持机体免疫平衡方面发挥重要作用。

　　1.1 CD4+CD25+Tregs功能的调节

　　1.1.1 Foxp3对CD4+CD25+Tregs的调节

　　Foxp3为叉头样转录因子家族成员， Brunkow 等［4］首次发现其与调节性T细胞的发育和功能密切相关。人类Foxp3基因位于Xp11.23， 由11个外显子和10个内含子组成， cDNA全长1896 bp， 编码的Foxp3蛋白Scurfin由431个氨基酸组成， 叉头状DNA结合域靠近C末端。Foxp3可通过下调IL2、TNF、GMCSF等细胞因子， 同时上调IL10发挥免疫抑制作用。通常认为Foxp3 mRNA及其编码蛋白只特异性表达于CD4+CD25+Tregs， 但Morgan等［5］发现， 用植物凝集素（PHA）或抗CD3和抗CD28联合刺激人CD25- PBMCs 24～40 h后， 其Foxp3 mRNA表达呈阳性。可见， Foxp3是否仅特异性表达于CD4+CD25+Tregs尚存争议。
　　
　　Foxp3基因缺陷或突变小鼠表现为淋巴细胞增殖病和各种自身免疫病， 而人类Foxp3基因突变可引起全面的免疫失调［6］， 表现为内分泌疾病、肠病、X染色体性联综合症（IPEX）。若阻断正常小鼠来源的CD4+CD25+Tregs Foxp3表达， 则CD25、 CD45RB、CTLA4及GITR等表面分子表达水平下调， 抑制功能明显降低; 而在高表达Foxp3的转基因小鼠体内， CD4+CD25+Tregs细胞数量明显增加。如果将正常小鼠的CD4+CD25+Tregs转输给Foxp3基因缺陷小鼠， 可防止自身免疫病的发生。以逆转录病毒为载体， 向CD4+CD25-T细胞转导Foxp3基因， 可使其获得CD4+CD25+Tregs细胞表型和功能［7］。Kim等［8］通过逆转录病毒向人白血病CD4+Jurkat-T细胞中转导Foxp3基因诱导其产生了Treg表型与功能。由此可见， Foxp3不仅决定了CD4+CD25+Tregs的表型与功能， 而且可以赋予靶细胞以Tregs样活性， 其作用可能是独立的。

　　1.1.2 Toll样受体对CD4+CD25+Tregs的调节

　　Toll样受体（Tolllike receptors， TLRs）属于在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用的模式识别受体（pattern recognition receptors， PRR）家族成员， 能够识别病原相关的分子模式（pathogenassociated molecular pattern， PAMP）， 如细菌、病毒、真菌和原虫等。通常认为TLR介导的对入侵病原体特定结构的识别在启动固有免疫的同时， 通过树突状细胞和其他抗原提呈细胞启动适应性免疫。TLR几乎表达于所有免疫细胞表面［9］， 如幼鼠CD4+CD25+Tregs选择性表达TLR4、TLR5、TLR7和TLR8， 然而TLR1、TLR2、TLR3和TLR6更广泛表达于CD4+T细胞而并不仅限于CD4+CD25+Tregs。近年研究表明［10］， TLR信号转导参与了由自身抗原、 同种异体抗原和异种抗原导致的炎症和免疫反应。
　　
　　最近发现， TLRs的内源性配体， 如hsp60或其肽段p277作用于CD4+CD25+Tregs， 可通过TLR2信号转导上调CD4+CD25+Tregs来下调适应性免疫应答［11］; TLR5的配体鞭毛蛋白可增强CD4+CD25+Tregs Foxp3的表达［12］; TLR8直接触发CD4+CD25+Tregs引起其免疫抑制功能消除［13］; TLR9的配体CpG寡聚核苷酸联合抗CD3单抗可诱导鼠CD4+CD25-和CD4+CD25+Tregs的增殖［14］。由此可见， TLR信号转导可直接或间接调节Tregs在免疫应答中的免疫抑制功能， 但具体机制尚不清楚， 一种解释是继不同TLRs受刺激后Foxp3表达的上调或下调可能与Treg细胞功能改变有关， 而TLR信号转导怎样影响Foxp3表达仍需进一步研究。

　　1.1.3 细胞因子对CD4+CD25+Tregs的调节

　　细胞因子对CD4+CD25+Tregs的生成及功能发挥起重要作用。IL2、TGFβ、IL10等免疫调节分子可控制CD4+CD25+Tregs的生成。其他的免疫细胞， 特别是抗原提呈细胞（APCs）对CD4+CD25+Tregs的生成也起关键作用， 而细胞因子可调节APCs和CD4+CD25+Tregs之间的相互作用。CD4+CD25+Tregs组成性表达IL2Rα链CD25， 但不能生成IL2， 用抗IL2抗体中和并耗尽小鼠体内的IL2会导致小鼠发生自身免疫病， 同时伴有外周血CD4+CD25+Tregs数目减少［15］， 表明IL2对于维持CD4+CD25+Tregs的稳定起重要作用。同样， IL2受体缺陷小鼠也可发生系统性自身免疫病， 这种系统性自身免疫病类似于新生期胸腺切除而致CD4+CD25+Tregs缺陷的小鼠， 推测可能是CD4+CD25+Tregs上的CD25分子能够与效应细胞竞争性结合IL2， 使效应细胞缺少生长信号刺激而无法增殖所致。
　　
　　TGFβ最初被认为是调控T细胞增殖和发挥效应功能的负性调节因子， 后来发现它也可以促进CD8+T细胞的增殖并使CD4+和CD8+T细胞分泌更多的TNFα， 具有抗凋亡功能。研究表明［16］， TGFβ可以诱导人类CD4+CD25-T细胞表达Foxp3， 在促进CD4+CD25+Tregs的增殖同时使Foxp3表达增加， 但仅对初始CD4+CD25+Tregs的诱导而言是必需的， 对于活化后的CD4+CD25+Tregs并非必需。Horwitz 等［17］发现， 部分中和IL2会消除TGFβ诱导的CD4+CD25+Tregs的抑制功能， 表明TGFβ单独作用不能对CD4+CD25+Tregs起调节作用， IL2和TGFβ联合作用可增强CD4+CD25+Tregs的抑制效应。近年Skapenko 等［18］报道了与IL4R结合的细胞因子， 如IL4和IL13可促进天然CD4+CD25+Tregs的生成。在体外， IL4和IL13可将人类CD4+CD25-初始T细胞转化为CD4+CD25+Tregs， 但依赖于抗原特异性刺激和B7协同共刺激。

　　2 CD4+CD25+Tregs与自身免疫性肝病

　　自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）是三种主要的侵犯肝脏的自身免疫病。AIH主要造成肝细胞损伤， PBC主要破坏小胆管， PSC主要表现为中大胆管损伤， 他们均以出现自身抗体为特征。自身免疫性肝病发病机制尚不清楚， 主要认为是环境因素作用于有遗传易感性的个体， 导致天然免疫耐受被打破， 发生对自身抗原的免疫应答， 通过自身抗原敏感性细胞毒T细胞介导的细胞毒和/或自身抗体依赖的细胞毒反应（ADCC）造成相应的靶组织损伤、靶细胞凋亡和坏死。人们已经注意到参与维持内环境稳定的细胞群， 如NK细胞、Th3、Tr1、CD8+CD28-、γδT细胞， 特别是CD4+CD25+Tregs可能与该病的发生发展有关。自身免疫性肝病在我国尚无明确的发病率报告， 据北京佑安医院的统计， 6000例肝功能异常患者中， AIH患者84例［19］; 在检测的3000例各种肝病患者中， PBC为52例占1.7%［20］。随着对该病认识的不断深入及临床检出率的增加， 已引起国内学者的重视。

　　2.1 CD4+CD25+Tregs与AIH

　　AIH是一种慢性炎症性肝脏疾病， 多累及青年女性， 男女比为1∶4， 以血清中转氨酶水平增高， 外周循环中出现自身抗体， 高IgG球蛋白血症和浆细胞浸润肝组织为特征， 对免疫抑制治疗有效， 组织学可见门静脉周围炎症和肝界面炎症。根据自身抗体特点将AIH分为三种， 1型AIH以抗核抗体（ANA）和/或平滑肌抗体（SMA）为特点; 2型AIH的典型抗体直接针对的是肝肾微粒体1型（LKM1）和/或肝细胞质1型（LC1）; 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原（SLA/LP）抗体的出现被认为是3型AIH的特点， 但具有争议的是有抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体的病人并不存在明显的临床特征。Wiegard 等［21］发现， 在正常条件下， CD4+CD25+Tregs可以抑制肝细胞激活的CD4+T细胞， 而在微生物存在条件下， 肝细胞可以抵抗CD4+CD25+Tregs的抑制作用， 使免疫耐受转为免疫应答。除CD4+T细胞外， AIH患者亦存在抗原特异性CD8+T细胞， 而CD4+CD25+Tregs在抑制自身反应性T细胞的增殖和效应功能发挥的同时， 还可下调CD8+T细胞产生IFNγ、IL4， 由此可见， CD4+CD25+Tregs在AIH发病中起重要作用。
　　
　　Longhi等［22］对AIH患者外周血CD4+CD25+Tregs数量及功能进行了系统研究， 发现AIH患者外周血CD4+CD25+Tregs数量缺失且功能受损; CD4+CD25+Tregs Foxp3的表达比健康对照低; CD4+CD25+Tregs与靶细胞直接接触引起调节性细胞因子IL4、 IL10、IFNγ和TGFβ分泌增加， 而患者中TGFβ的分泌却明显低于健康对照。在AIH发病期， CD8+T细胞增殖能力非常显著， 远远高于疾病缓解期和正常人， 而在药物诱导的缓解期， CD8+T细胞反应性恢复正常， 这表明CD8+T细胞的超反应性可能参与肝脏损害。在疾病缓解期， CD4+CD25+Tregs能诱导CD8+T细胞产生更多的具有免疫下调功能的IL4， 因此， CD4+CD25+Tregs和CD8+T细胞在免疫应答的调节上发挥了协同免疫抑制作用。同时还发现， CD4+CD25+Tregs的增加并不影响靶细胞的凋亡， 但AIH患者CD4+CD25-T细胞自发凋亡减少， 这也可能与自身免疫的发生有关。

　　2.2 CD4+CD25+Tregs与PBC

　　PBC是一种慢性胆汁郁积性肝脏疾病， 多累及中老年女性， 男女比为1∶9， 抗线粒体（AMA）抗体阳性及高IgM球蛋白血症为本病的重要特征。AMA针对的靶抗原主要是位于胆管上皮细胞线粒体内膜上的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位（PDCE2）， 常引起小叶间胆管损害。近年研究发现， PBC患者胆管损伤部位有大量单核细胞和巨噬细胞浸润， 而CD4+CD25+Tregs可以通过抑制单核细胞和巨噬细胞产生TNFα、IFNγ、IL6等细胞因子减轻炎症反应和组织损伤。Lan等［23］发现， PBC患者外周血CD4+CD25+Tregs数量低于健康对照， 外周血单核细胞和肝脏浸润淋巴细胞CD4+CD25+Tregs比例低于丙型肝炎患者， 肝脏浸润淋巴细胞中含有更多的PDC特异性B细胞， 说明肝脏中CD4+CD25+Tregs数量减少可能诱导自身反应性B细胞产生AMA。有趣的是， 他们在PBC患者姊妹中也发现了CD4+CD25+Tregs的缺乏， 提示基因水平上对CD4+CD25+Tregs数量的调控可能与PBC患者免疫耐受缺陷有关。Sasaki等［24］发现PBC患者胆管炎症区CD4+CD25+Tregs数量增加， 增加程度与炎症损害程度相关， 说明PBC患者外周血和肝内Tregs数量在反映肝损伤程度上的变化是一致的， 推测机体可能通过免疫调节使具有抑制作用的CD4+CD25+Tregs代偿性增殖来增强对效应T细胞的抑制作用。

　　3 结语

　　人们对CD4+CD25+Tregs发挥免疫抑制功能的机制尚在探索之中， 其在自身免疫性肝病中作用的研究也刚刚起步， 进一步探讨二者之间的关系不仅可以深入了解CD4+CD25+Tregs在生理和病理情况下的作用特点， 还可以从新的角度探究自身免疫性肝病发病机制。例如， 在研究PBC患者Tregs的同时发现了该病在一级亲属中的遗传易感性， 提示我们可能还存在新的免疫调节基因多态性。国外已经尝试体外诱导扩增AIH患者的Tregs［25］， 这为采用免疫疗法重建自身免疫病患者体内免疫耐受以及新的治疗药物的研发指明了新的方向。

参考文献

　　［1］Sakaguchi S， Sakaguchi N， Asano M， et al. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL2 receptor alphachains (CD25). Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases［J］. J Immunol， 1995， 155(3): 1151-1164.

　　［2］Bruder D，ProbstKepper M，Westendorf AM， et al. Neuropilin1: a surface marker of regulatory T cells［J］. Eur J Immunol， 2004， 34(3): 623-630.

　　［3］Peng Y， Laouar Y， Li MO， et al.TGFbeta regulates in vivo expansion of Foxp3expressing CD4+CD25+regulatory T cells responsible for protection against diabetes［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101(13): 4572-4577.

　　［4］Brunkow ME， Jeffery EW， Hjerrild KA， et al. Disruption of a new forkhead/wingedhelix protein， scurfin， results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse［J］. Nat Genet， 2001， 27(1): 68-73.

　　［5］Morgan ME， van Bilsen JH， Bakker AM， et al. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans［J］. Human Immunol， 2005， 66(1): 13-20.

　　［6］Chatila TA， Blaeser F，Ho N， et al.Jm2 encoding a fork headrelated protein， is mutated in Xlinked autoimmunityallergic disregulation syndrome［J］. J Clin Invest， 2000， 106(12): R75-81.

　　［7］Hori S，NomuraT， Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］. Science， 2003， 299(5609): 1057-1061.

　　［8］Kim JY， Kim HJ， Hurt EM， et al. Functional and genomic analyses of FOXP3transduced JurkatT cells as regulatory T (Treg)like cells［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 362(1): 44-50.

　　［9］Caramalho I， LopesCarvalho T，Ostler D， et al. Regulatory T cells selectively express tolllike receptors and are activated by lipopolysaccharide［J］. J Exp Med， 2003， 197(4): 403-411.

　　［10］Uematsu S， Sato S， Yamamoto M，et al. Interleukin1 receptorassociated kinase1 plays an essential role for Tolllike receptor (TLR)7 and TLR9mediated interferon{alpha} induction［J］. J Exp Med， 2005， 201(6): 915-923.

　　［11］ZaninZhorov A， Cahalon L， Tal G， et al. Heat shock protein 60 enhances CD4+CD25+ regulatory T cell function via innate TLR2 signaling［J］. J Clin Invest， 2006， 116(7): 2022-2032.

　　［12］Crellin NK， Garcia RV， Hadisfar O， et al. Human CD4+ T cells express TLR5 and its ligand flagellin enhances the suppressive capacity and expression of FOXP3 in CD4+CD25+ T regulatory cells［J］. J Immunol， 2005， 175(12): 8051-8059.

　　［13］Peng G， Guo Z， Kiniwa Y， et al. Tolllike receptor 8mediated reversal of CD4+ regulatory T cell function［J］.Science， 2005， 309(5739): 1380-1384.

　　［14］Chiffoleau E， Heslan JM， Heslan M， et al. TLR9 ligand enhances proliferation of rat CD4+ T cell and modulates suppressive activity mediated by CD4+CD25+T cell［J］. Int Immunol， 2007， 19(2): 193-201.

　　［15］Setoguchi R， Hori S， Takahashi T， et al. Homeostatic maintenance of natural Foxp3+ CD25+ CD4+ regulatory T cells by interleukin (IL)2 and induction of autoimmune disease by IL2 neutralization［J］. J Exp Med， 2005， 201(5): 723-735.

　　［16］Yamagiwa S， Gray JD， Hashimoto S， et al. A role for TGFβ in the generation and expansion of CD4+CD25+regulatory T cells from human peripheral blood［J］. J Immunol， 2001， 166(12): 7282-7289.

　　［17］Horwitz DA， Zheng SG， Gray JD. The role of the combination of IL2 and TGFβ or IL10 in the generation and function of CD4+CD25+and CD8+ regulatory T cell subsets［J］. J Leukoc Biol， 2003， 74(4): 471-478.

　　［18］Skapenko A， Kalden JR， Lipsky PE， et al. The IL4 receptor alphachainbinding cytokines， IL4 and IL13， induce forkhead box P3expressing CD25+CD4+ regulatory T cells from CD25-CD4+ precursors［J］. J Immunol， 2005， 175(9): 6107-6116.

　　［19］赵艳， 闫惠平， 檀玉芬， 等. 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体在自身免疫性肝炎诊断及分型中的意义［J］. 中华肝脏病杂志， 2007， 15(4): 283-286.

　　［20］闫惠平， 庄辉， 刘燕敏， 等. 原发性胆汁性肝硬化患者的免疫学特点分析［J］. 中华肝脏病杂志， 2005， 13(1): 12-16.

　　［21］Wiegard C， Frenzel C， Herkel J， et al. Murine liver antigen presenting cells control suppressor activity of CD4+CD25+regulatory T cells［J］. Hepatology， 2005， 42(1): 193-199.

　　［22］Longhi MS， Hussain MJ， Mitry RR， et al. Functional study of CD4+CD25+ regulatory T cells in health and autoimmune hepatitis［J］. J Immunol， 2006， 176(7): 4484-4491.

　　［23］Lan RY，Cheng C， Lian ZX， et al. Livertargeted and peripheral blood alterations of regulatory T cells in primary biliary cirrhosis［J］. Hepatology， 2006， 43(4): 729-737.

　　［24］Sasaki M， Ikeda H， Sawada S， et al. Naturallyoccurring regulatory T cells are increased in inflamed portal tracts with cholangiopathy in primary biliary cirrhosis［J］. J Clin Pathol， 2007， 60(10): 1102-1107.

　　［25］Longhi MS， Meda F， Wang P， et al. Expansion and de novo generation of potentially therapeutic regulatory T cells in patients with autoimmune hepatitis［J］. Hepatology， 2008， 47(2): 581-591.