VCC1真核表达载体的构建及肝癌细胞SMMC7721稳定转染株的建立及鉴定

　　　　作者：牟霞， 陈瑶， 王穗海， 黄湘， 李明

【摘要】 　　目的: 构建pcDNA3.1(-)/VCC1真核表达载体并将其稳定转染到肝癌细胞系SMMC7721中。方法: 以SMMC7721细胞总RNA为模板， 通过RTPCR扩增VCC1基因编码区cDNA， 并将扩增的cDNA片段与pMD19T载体连接后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中。重组子经酶切分析及测序鉴定后， 用脂质体转染技术将其导入到人肝癌细胞系SMMC7721， 经G418筛选并建立稳定的转染细胞株， 应用RTPCR及Western blot检测转染前后该细胞株VCC1基因的表达。结果: pcDNA3.1(-)/VCC1经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确， 真核表达载体构建成功; 经RTPCR及Western blot检测， 重组质粒转染株的VCC1基因的表达水平高于对照组， 证实VCC1基因稳定转染到SMMC7721细胞中并得到表达。结论: 成功地建立了人基因VCC1的肝癌细胞SMMC7721稳定转染株， 为进一步研究VCC1的功能奠定了基础。

【关键词】 VCC1; 载体构建; 转染

　　VCC1（VEGF correlated chemokine 1）基因是新近发现的一个趋化因子， 被命名为VEGF相关的趋化因子1， 该基因编码119个氨基酸， 含有6个半胱氨酸残基， 其中4个分别位于2个CXC结构域中， 目前列为CXCL17。研究发现VCC1在乳腺癌、 结肠癌中高表达， 并与血管形成相关， 在肿瘤的发生发展中可能扮演重要角色［1］。为了研究VCC1基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响， 我们将VCC1 基因克隆构建到真核表达载体上， 并稳定转染到SMMC7721肝癌细胞中。

　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α和人肝癌细胞系SMMC7721均由本实验室保存， pMD19T载体购自大连宝生物工程有限公司， MMLV逆转录酶购自Promega公司， 各种分子克隆工具酶购自MBI公司， 脂质体Lipofectamine2000、 TRIzol试剂、 G418和pcDNA3.1(-)真核表达载体购自 Invitrogen公司， RPMI1640、 胎牛血清(FBS)等购自GibcoBRL公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 SMMC7721总RNA的提取 按照TRIzol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的SMMC7721， 加TRIzol试剂1 mL， 静置3～5 min。加入氯仿0.5 mL， 混匀。室温静置2～3 min后， 12 000 r/min离心15 min。于上清中加人0.5 mL异丙醇， 室温静置10 min。10 000 r/min离心10 min。弃上清， 加入750 mL/L乙醇1 mL， 7 500 r/min离心5 min， 干燥沉淀， 加入30 μL DEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后， 用紫外分光光度计测定其纯度并定量， 保存于-80℃备用。

　　1.2.2 引物设计 根据GenBank的基因序列(AY358433)， 设计扩增VCC1编码区cDNA上、 下游引物。上、 下游引物中分别引入Xho I、 BamH I酶切位点， 扩增片段为360 bp。上游5′CTCGAGATGAAAGTTCTAATCTCTTCCC3′， 下游 5′GGATCCCAAAGGCAGAGCAAAG3′; 内参照βactin的引物序列为: 上游5′TGTGACGTGGACATCCGCAAAG3′， 下游5′TGGAAGGTGGACAGCGAGGC3′， 扩增片段为206 bp。并设计作为转染SMMC7721细胞后鉴定用的G418抗性基因PGK neo的特异性引物: 上游5′AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG3′， 下游5′AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG3′， 扩增片段为492 bp。所有引物均由Invitrogen公司合成。

　　1.2.3 逆转录合成cDNA逆转录 反应体系为: 细胞总RNA 1 μg， h3O 13 μL， oligdT 0.5 μg， 70℃ 5 min， 立刻冰上放置， 加入MMLV 200 u， dNTP 10 nmol， 5×MMLV Buffer 5 μL， Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 25 u， 混匀后42℃ 1 h， 70℃ 10 min。取10 μL反转录产物进行PCR反应， 采用降落PCR (Touch down_PCR)， 反应条件: 94℃ 预变性4 min; 94℃变性 30 s， 60℃退火 90 s， 72℃延伸 40 s， 随后每个循环退火温度降低0.5℃， 其他条件不变， 共进行10个循环。然后: 94℃ 30 s， 60℃ 90 s， 72℃ 40 s扩增20个循环， 72℃延伸7 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后， 切胶回收目的片段。

　　1.2.4 T载体克隆 对PCR产物进行割胶纯化， 将目的片段与pMD19T载体连接。连接反应体系为: Solution I 5 μL， pMD19T DNA 50 ng， PCR产物50 ng， ddh3O 3 μL， 置于16℃ 2 h后， 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态， 在氨苄青霉素抗性平板上筛选生长， 挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定， 并命名为: pMD19T/VCC1。

　　1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1(-)/VCC1的构建 用BamH I、 Xho I分别双酶切重组pMD19T/VCC1质粒及pcDNA3.1(-)空载体， 凝胶电泳后回收目的片段， 16℃连接10 h。连接、 转化， 方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序正确后扩大培养， 抽提重组质粒DNA。

　　1.2.6 细胞培养 SMMC7721细胞在含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中， 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵箱中培养。

　　1.2.7 SMMC7721细胞的基因转染和筛选培养 将处于对数生长期的SMMC7721细胞以4×105个细胞/孔接种于6孔板中， 培养24 h， 使细胞达到80%～90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前1 h先予细胞更换无血清培养基， 使细胞适应条件变更。并准备以下2种溶液， A液: 4 μg质粒DNA溶于150 μL无血清培养液中; B液: 4 μL脂质体溶于150 μL无血清培养液中。将A液与B液混匀， 室温孵育30 min， 以形成DNA脂质体复合体， 加入培养液中。培养8～14 h， 更换为完全培养液， 继续培养24 h， 次日于完全培养液中加入800 mg/L的G418继续进行培养， 2周后G418浓度改为400 mg/L维持筛选。用选择培养液培养4周后， 分离阳性克隆并扩大培养备用。

　　1.2.8 转染后VCC1表达的鉴定 分别以βactin和GADPH为内参照， 对VCC1基因在转染细胞内目的基因的mRNA及蛋白表达情况进行鉴定。分别收集稳定转染空载体重组质粒的细胞， 样品处理后进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、 转膜、 TBST缓冲液洗膜、 50 g/L脱脂牛奶封闭。一抗为VCC1小鼠多抗， 二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG， ECL显色。

　　2 结果

　　2.1 总RNA提取 用一步法成功提取SMMC7721总RNA， 总RNA电泳结果可见有5 S、 18 S和28 S 3条带。

　　2.2 RTPCR扩增产物的鉴定及真核表达载体的构建与鉴定 SMMC7721总RNA经RTPCR扩增， 扩增产物电泳结果可见在约360 bp处有一特异性扩增条带(图2)， 与预期的扩增片段大小相符。将用BamH I、 Xho I双酶切重组质粒pMD18T/VCC1得到的目的基因插入pcDNA 3.1(-)空质粒， 获得pcDNA3.1(-)/VCC1真核表达质粒， 该质粒再经BamH I、 Xho I双酶切鉴定， 得到了360 bp的目的片段和约5 400 bp的载体片段（图1）， 送测序证实该质粒含有完全正确的VCC1 cDNA序列。

　　图1 RTPCR扩增产物及重组质粒pcDNA3.1(-)/VCC1双酶切鉴定（略）

　　M: DL 2 000 DNA marker; 1: pcDNA3.1(-); 2: pcDNA3.1(-)/VCC1; 3: VCC1 RTPCR扩增产物.

　　2.3 稳定表达株的筛选与鉴定 将pcDNA3.1(-)/VCC1质粒转染入人肝癌细胞系SMMC7721， 经4周选择性培养（400 mg/L G418）后， 得到了稳定表达目的基因mRNA的阳性细胞株。筛选后的VCC1稳定表达细胞经RTPCR及Western blot方法分析， 转染了pcDNA3.1(-)/VCC1的SMMC7721细胞与对照转染空载体及未转染的SMMC7721细胞相比， 三者的内参表达水平差别不大， 转染了pcDNA3.1(-)/VCC1的SMMC7721细胞扩增后的VCC1目的条带明显比对照转染空载体的亮， 说明重组子已成功转入SMMC7721细胞并得到表达， 而且转染了pcDNA3.1(-)/VCC1或空pcDNA3.1(-)质粒的SMMC7721细胞扩增后均得到1条大小为492 bp的条带(PGKneo)， 而未转染的SMMC7721细胞没有扩增出该条带， 说明VCC1已转入到SMMC7721细胞中(图2、 3)。

　　图2 各转染组细胞VCC1基因的mRNA水平变化（略）

　　M: DNA marker; 1， 2: 空白未转染SMMC7721细胞组; 3， 4: 转染pcDNA3.1(-)空载体组; 5， 6: 转染pcDNA3.1(-)/VCC1组.

　　图3 各转染组细胞VCC1基因蛋白水平变化（略）

　　M: 蛋白marker; 1: 转染pcDNA3.1(-)/VCC1组; 2: 转染pcDNA3.1(-)空载体组; 3: 空白未转染SMMC7721细胞组.

　　3 讨论
　　
　　大量研究表明［2-4］， VEGF及趋化因子与肿瘤的血管发生、 细胞形态学、 细胞迁移、 凋亡等有密切联系。VCC1作为一个与VEGF相关的蛋白， 结构与CXC类趋化因子相似， 研究显示其在血管形成中扮演了重要角色， 而且可能在一些组织的肿瘤发生及免疫调节中具有重要作用［5］。为进一步研究VCC1过表达后对肿瘤细胞的生物学功能的影响， 在本实验中我们将此基因构建在真核细胞表达载体pcDNA3.1(-)， 经限制性核酸内切酶酶切鉴定、 测序证实目的基因VCC1序列正确， 成功构建重组子pcDNA/VCC1 。然后将所构建的含VCC1 基因的重组质粒转染到SMMC7721细胞， 并用G418筛选稳定转染细胞株， 选择抗性克隆， 将新的克隆细胞挑选出扩大培养。由于VCC1 基因是一个在肿瘤广泛表达的基因， SMMC7721细胞中也有表达， 因此为了鉴定VCC1 基因是否已经转染到SMMC7721细胞中， 我们可以通过扩增G418抗性基因PGKneo序列来鉴定， 因为pcDNA3.1(-)中带有G418抗性基因PGKneo， 该序列是很特异的， 人的SMMC7721细胞中不含有该序列， 如果没有转染的细胞， 那么就扩增不出492 bp的特异条带。而且转染了VCC1 基因的SMMC7721细胞， 其VCC1目的条带比转染了空质粒的SMMC7721及未转染的SMMC7721细胞在mRNA水平及蛋白水平表达量均增加， 表明VCC1 基因已经转染到SMMC7721细胞中并且有此蛋白的过量表达。本实验为进一步研究VCC1 基因对肿瘤细胞的生物学功能的影响奠定了实验基础。

参考文献

　［1］ Weinstein EJ， Head R， Griggs DW， et al. VCC1， a novel chemokine， promotes tumor growth［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2006， 350(1): 74-81.

　　［2］ Brand S， Dambacher J， Beigel F， et al. CXCR4 and CXCL12 are inversely expressed in colorectal cancer cells and modμlate cancer cell migration， invasion and MMP9 activation［J］. Experimental Cell Research， 2005， 310(1): 117-130.

　　［3］ He W， Liu Q， Wang L， et al. TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance［J］. Mol Immunol， 2007， 44(11): 2850-2859.

　　［4］ 王宏光， 李开宗， 窦科峰， 等. 血管内皮生长因子及其受体在肝癌细胞中的表达及意义［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2001， 17（4）: 359-361.

　　［5］ Kanazawa H， Hirata K， Yoshikawa J， et al. Imbalance between vascμlar endothelial growth factor and endostatin in emphysema［J］. Eur Respir J， 2003， 22(4): 609-612.