小鼠SKA1蛋白的多克隆抗体制备、鉴定与初步应用

【摘要】 　　目的: 制备兔抗鼠SKA1(Spindle and Kinetochore Associated 1)多克隆抗体。方法: 利用PCR的方法得到小鼠SKA1基因并克隆至pGEX2T 原核表达载体中， 转化入大肠杆菌BL21表达， 经IPTG 诱导表达GSTSKA1融合蛋白， 经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体， 通过ELISA测定抗鼠SKA1多克隆抗体效价， 用Western blot测定其特异性。结果: 构建了pGEX2T　SKA1原核表达重组质粒， 并诱导表达出GSTSKA1融合蛋白， 免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定表明SKA1多克隆抗体效价为1∶25 600， Western blot分析表明SKA1多克隆抗体具有良好的特异性。通过免疫组织化学方法发现， SKA1表达于高分化前列腺癌细胞中。结论: 成功地制备了效价及特异性良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体， 为SKA1基因功能的研究奠定基础。

【关键词】 SKA1基因; 纺锤体检测点; 多克隆抗体; 肿瘤; 小鼠

　　细胞分裂周期是一个严格调控、 高度有序的过程， 由细胞内固有的细胞周期检测点(cell cycle checkpoints)来检查完成， 以保证细胞复制的忠实性［1］。检测点功能缺陷可能会导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖， 从而导致肿瘤发生［2］。Sauer等［3］（2005）通过对处于有丝分裂期的人HeLa细胞的纺锤体（spindle）进行蛋白组学分析， 发现了154个未知功能的蛋白， 其中包括C18orf24 (SKA1)。Hanisch等［4］研究发现人C18orf24(SKA1)与FAM33A(SKA2)形成蛋白复合物， 功能性下调某些周期检测点激酶的表达， 具有导致纺锤体检测点沉默（Spindle checkpoint silencing）的作用。另外他们的研究还发现， SKA蛋白与MAD2附着于着丝粒的时候， 存在着相反的条件要求。而其他研究表明［5］， 在不同肿瘤细胞中确实存在着由于MAD2的突变， 导致了纺锤体检测点的功能缺陷。小鼠SKA1基因位于第18号染色体上， 其cDNA长度为2 500 bp， 最大开放阅读框（ORF）编码254个氨基酸， 与人SKA1氨基酸序列（255个氨基酸）的同源性达到了75%， 相似性达到了86%。然而目前对于SKA1在体内的作用的研究， 尤其是在肿瘤发生发展中的分子效应机制方面了解甚少。因此本试验旨在制备SKA1多克隆抗体， 为进一步的研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　E.coli DH5α， BL21菌株及质粒pGEX2T均由本实验室保存。Taq DNA聚合酶， Sma I限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Roche公司。质粒提取试剂盒、 弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。GlutathioneSepharose 4B亲和层析柱和ProteinA Sepharose购自GE公司。其他试剂购自CALBIOCHEM公司。雄性新西兰大耳白兔（2.5～3.0 kg）购自加拿大西安大略大学动物中心（ACVS， UWO， CA）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组质粒的构建

　　以SKA1 cDNA (Invitrogene cDNA clone MGC: 28070)为模板， 以P1 (5′GGGTTCCCGGGATGGACTCAGAGCTAGAAG3′) 和P2 (5′CGTCACTCCCGGGGCCTCAGG3′)为引物， PCR扩增SKA1的编码第1254位氨基酸的SKA1片段。将经Sma I酶切PCR产物插入到同样用Sma I酶切的pGEX2T载体中， 即得重组质粒pGEX2TSKA1。上述克隆所用PCR扩增条件为: 94℃变性3 min后， 按以下参数进行30次循环: 94℃变性30 s， 55℃复性1 min， 72℃延伸1 min。最后72℃延伸10 min。PCR扩增所用酶为Taq DNA聚合酶。重组质粒经载体上的通用引物测序。

　　1.2.2 GST融合蛋白的诱导表达及纯化

　　将重组质粒pGEX2TSKA1和表达GST的空载体pGEX2T转化到E.coli BL21中。37℃振荡过夜， 再按2%的接种量转接， 30℃培养6 h后， 加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L， 20℃继续诱导培养过夜。收集上述诱导菌， 用GlutathioneSepharose 4B小颗粒纯化GST融合蛋白， 按GE公司提供的方法进行， 即按10∶1 (V/V)的比例加入细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCL pH7.5、 150 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.3 mmol/L DTT、10 mL/L NP40及蛋白酶抑制剂)， 超声破碎， 离心收集上清液， 加入适量GlutathioneSepharose 4B小颗粒， 结合3 h。再收集GlutathioneSepharose 4B小颗粒， 用细胞裂解液充分洗去未结合蛋白质后， 即得到结合有GSTSKA1融合蛋白或GST蛋白的GlutathioneSepharose 4B小颗粒。

　　1.2.3 多克隆抗体的制备

　　将纯化后的融合蛋白GSTSKA1与弗氏完全佐剂1∶1混匀后， 皮下多点注射新西兰大耳白兔， 初次免疫后每10 d使用不完全弗氏佐剂加强免疫1次， 共3次。末次免疫后第10天取血， 免疫血清于-70℃保存。

　　1.2.4 抗血清的纯化

　　3mL兔血清中加入300mL的1 mol/LTrisHCL(pH8.0）。将上述溶液通过用10 mmoL/L的TrisHCl (pH8.0)平衡过ProteinA Sepharose（1mL）。用10mL的100 mmol/LTrisHCL (pH8.0)洗涤。用2mL的50 mmol/L GlyHCl（pH3.0）洗脱。1mol/L TrisHCl (pH8.0)中和样品， 调pH值至7.4。Millipore蛋白纯化柱离心除盐， 浓缩， -70℃保存。

　　1.2.5 SKA1多克隆抗体效价的检测

　　将纯化后的GSTSKA1融合蛋白（100 ng/孔）包被酶联板， 分别以不同稀释倍数的免疫前兔血清和免疫后兔血清作为一抗， 间接法ELISA测定多抗的效价。

　　1.2.6 Western blot的检测

　　收集生长良好的1×107的NIH3T3细胞， 裂解（150 mmol/L NaCl， 10 mmol/L NP40， 1 mmol/L PMSF， 1 mmol/L Cocktail）， 10 000 g， 4℃离心30 min后， 取上清。SDS电泳， 转膜， 100 g/L BSA封闭过夜。一抗为纯化后的兔抗鼠SKA1抗体（1∶2 000）， ECL试剂盒显色（Pierce Biotech， CA）。

　　1.2.7 KIMAP小鼠［6］

　　高分化前列腺癌细胞中SKA1的表达 选择经病理证实的小鼠高分化前列腺癌标本， ABC法免疫组织化学检测［7］。

　　2 结果

　　2.1 小鼠SKA1基因编码区760 bp片段的克隆和表达载体的构建

　　以P1、P2为引物， PCR扩增获得1条约760 bp左右的条带， 与目的片段大小相近(图1)。PCR产物插入pGEX2T载体， 转化菌质粒用Sma I酶切下约760 bp左右片段(图2)。DNA序列分析表明质粒为SKA1基因的克隆， 序列与GenBank报道序列完全一致。

　　2.2 GSTSKA1融合蛋白在大肠杆菌中的表达

　　将重组质粒pGEX2TSKA1转化到E.coli BL21中， 转化菌经IPTG诱导后进行SDSPAGE。结果表明(图3)， 与阴性对照BL21相比， BL21(pGEX2TSKA1)特异地表达了Mr 约为55 000左右的预期蛋白， 说明GSTSKA1融合蛋白的构建及表达获得成功。

　　2.3 GSTSKA1融合蛋白的纯化

　　GSTSKA1融合蛋白在E.coli中经低温诱导表达后， 获得了较大量的可溶性蛋白。这些可溶性蛋白经GlutathioneSepharose 4B小颗粒亲和层析后进行SDSPAGE。结果表明(图4)， GSTSKA1融合蛋白和GST均为单一的蛋白条带。

　　2.4 SKA1多克隆抗体的检测

　　将重组蛋白作为抗原， 间接法ELISA测定多抗效价。结果表明SKA1多克隆抗体的效价约为1∶25 600。以GSTSKA1融合蛋白和GST蛋白进行SDSPAGE， 用纯化后的抗SKA1抗体进行Western blot分析， 结果表明（图5） Mr 28 000和55 000附近出现条带， 分别是GST蛋白和GSTSKA1融合蛋白。提取小鼠NIH3T3细胞总蛋白， 进行SDSPAGE， SKA1抗体进行Western blot检测分析， 结果表明（图6）， 在Mr 30 000的位置， 出现了预期的蛋白条带。

　　2.5 SKA1在高分化前列腺癌细胞中的表达

　　免疫组织化学检测高分化前列腺癌细胞表明， SKA1主要表达于细胞核中， 但是也有部分分布于细胞质中（图7）。

　　3 讨论

　　SKA1基因是一个新近发现与有丝分裂相关的基因［3］， 已发现其具有导致纺锤体检测点沉默的功能［4］。之前的研究中［8， 9］， Gabril等利用cDNA差异表达芯片技术和生物信息学分析发现， 小鼠SKA1（NM_025581）基因在前列腺肿瘤小鼠（KIMAP）模型中， 肿瘤发生前期（20周）表达上调92倍， 后期（60周）表达上调117倍， 揭示了小鼠SKA1基因与肿瘤的发生发展可能有着重要的相关性。
　　
　　由于目前还没有出现商业化小鼠SKA1特异抗体， 制约了对SKA1基因功能的深入研究。虽然单克隆抗体具有特异性、 性质稳定和重复性好等特点， 但操作复杂， 费时费力， 存在局限性。多克隆抗体具有简单、 快速和效果好等优点。为了获得特异性针对SKA1有反应原性的抗体， 本实验选取了SKA1蛋白编码区（1～254位氨基酸）作为抗原区。采用pGEX2T原核表达载体， 该表达载体带有Mr 约为29 000的GST多肽序列标签， 使融合蛋白便于检测和纯化， 同时可防止表达蛋白被宿主菌降解。本研究成功构建了pGEX2TSKA1重组质粒。通过对重组质粒的酶切， PCR鉴定以及核苷酸序列比对， 确保了插入序列与靶基因的一致性。诱导表达后的重组蛋白， 经过SDSPAGE分析， 位于Mr 55 000左右位置， 与理论值相符。免疫后获得的抗血清， 经间接ELISA法测得其有效滴度为1∶25 600。Western blot分析表明， 经过ProteinA Sepharose柱层析后的SKA1多克隆抗体， 可以特异性识别GSTSKA1融合蛋白; 也可以识别NIH/3T3细胞中的SKA1蛋白。通过免疫组化的方法， 检测到了SKA1在前列腺癌小鼠模型（KIMAP）高分化前列腺癌细胞中的表达分布。
　　
　　由抗原抗体相互作用发展起来的一系列技术， 如免疫共沉淀、 Western blot检测和免疫组织化学等， 在蛋白质的检测和功能研究中都有着广泛的应用。在本研究中， 成功制备获得了特异性高和效价良好的兔抗鼠SKA1多克隆抗体， 并可用于Western blot分析和免疫组织化学研究， 为继续深入研究SKA1的分布表达、 细胞内定位及其他蛋白间相互作用奠定良好基础。

参考文献

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