酪氨酸激酶抑制剂A77 1726阻断IL13对成纤维细胞的促胶原合成作用

　　　　作者：熊丽霞， 李文林， 石小玉， 刘卓琦， 唐洪林

【摘要】 　　目的: 观察酪氨酸激酶抑制剂A77 1726对白细胞介素13（IL13）促成纤维细胞胶原合成作用的影响。方法: MTT法观察不同浓度的A77 1726对成纤维细胞的增殖作用的影响。成纤维细胞分为实验组和实验对照组， 实验对照组加入IL13（100 μg/L）， 实验组加入A77 1726（50 μmol/L）和IL13（100 μg/L）， 作用24、 48、 72 h后， 羟脯氨酸(Hyp)检测A77 1726对IL13促进成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响， RTPCR观察A77 1726对IL13促进成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平表达的影响， Western blot观察A77 1726对IL13促进成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的影响。结果: A77 1726可抑制成纤维细胞的增殖。羟脯氨酸检测实验组48 h组和72 h组成纤维细胞分泌胶原蛋白的含量显著低于实验对照组（P&<0.05）， RTPCR观察到实验组48 h组和72 h组成纤维细胞I型胶原α1基因（COL1A1）mRNA表达水平显著低于实验对照组（P&<0.05）， Western blot观察到实验组48 h组和72 h组成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的水平显著低于空白对照组（P&<0.05）。结论: 酪氨酸酶抑制剂A77 1726阻断IL13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用， 阻断IL13促成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平和蛋白水平的表达。

【关键词】 酪氨酸酶抑制剂; A77 1726; 白细胞介素13; 成纤维细胞; 胶原

　　A77 1726是免疫调节药来氟米特（Leflunomide， LEF）的中间代谢产物。LEF是一种具有多重生理活性的新型的异恶唑类免疫抑制剂， 口服吸收后在肝脏和肠壁内被迅速代谢为A77 1726， 并通过A77 1726在体内发挥免疫调节作用， 该代谢物的一个重要作用是抑制酪氨酸激酶活性［1， 2］。已证实IL13是许多II类细胞因子决定的病理过程的关键诱导物， 与多种纤维化疾病的发病机制有关［3， 4］， 我们前期实验结果显示细胞因子IL13可通过JAK（细胞内一组酪氨酸蛋白激酶）STAT6（信息传导和转录激活因子）信号转导通路促进成纤维细胞胶原蛋白的合成［5， 6］， 本实验进一步通过体外培养成纤维细胞， 观察A77 1726对成纤维细胞增殖的影响， 以及A77 1726和IL13共同作用成纤维细胞， 观察I型胶原α1基因表达及对I型胶原蛋白合成的变化， 以探讨A77 1726是否通过抑制JAK/STAT6信号转导通路而阻断纤维化的部分机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 成纤维细胞株3T3细胞， 常规培养在含150 mL/L胎牛血清、 1×105 U/L的青、 链霉素的DMEM培养液中， 置于37℃、 含50 mL/L的CO2孵箱中培养， 实验前， 实验组和对照组细胞均用无血清DMEM培养12～16 h， 实验组加入A77 1726（50 μmol/L）和IL13（100 μg/L）， 实验对照组加IL13（100 μg/L）（浓度已做过优化实验， 此浓度最佳）。IL13、 Peprotech公司， A77 1726为美国欣凯公司上海代表处惠赠， 羊抗I型胶原蛋白抗体、 羊抗βactin抗体、 Santa Ｃruz公司， HRP兔抗羊IgG（II抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Western blot Luminol Reagent(sc2048): Santa Cruz。COL1A1特异性引物， TaKaRa公司(大连宝生物)， F: 5′ACAgAggCATAAAgggTCA3′; R: 5′CAAggTCACggTCACgAA3′。SV total RNA isolation system（Promega）， RTPCR kit（TaKaRa公司）， 羟脯氨酸试验检测盒购自南京建成生物工程研究所。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT法检测A77 1726对成纤维细胞的增殖影响 将细胞以2.5×107/L密度接种于用 96 孔培养板中， 每孔100 μL， 37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养至细胞贴壁， 加入A77 1726， 使之终浓度分别为0 μmol/L、 25 μmol/L、 50 μmol/L、 75 μmol/L、 100 μmol/L， 每一浓度重复5孔， 37℃、 5 mL/L CO2孵箱中培养 20 h ， 每孔加入 MTT 20 μL， 继续培养4 h， 吸弃培养基， 用无血清培养液洗 1 次， 加150 μL二甲基亚枫溶解沉淀， 振荡10 min， 结晶物溶解。比色: 选择570 nm波长， 在酶联免疫检测仪上， 以空白孔调零， 测定各孔光吸收值。以空白未加药物组作为对照组， 其余各组抑制率=(1-实验组A)/对照组A×100%。

　　1.2.2 羟脯氨酸释放试验观察A77 1726对IL13促进成纤维细胞分泌胶原的影响 成纤维细胞以5×108/L接种于培养瓶， 细胞汇合达80%左右时， 无血清DMEM培养12～16 h， 实验对照组加IL13（100 μg/L）单独作用24、 48、 72 h， 实验组为IL13（100 μg/L）和A77 1726（50 μmol/L）共同作用成纤维细胞24、 48、 72 h， 细胞培养上清液进行羟脯氨酸释放实验， 比较各实验组和实验对照组羟脯氨酸含量的差别， 按试剂盒说明操作。

　　1.2.3 RTPCR检测A77 1726对IL13促成纤维细胞I型胶原α1 mRNA表达的影响 取对数生长期细胞， 无血清DMEM培养12～16 h， 实验分组同1.2.2， 用SV total RNA isolation system提取总RNA， 逆转录合成第1条cDNA， 使用COL1A1特异性引物， 按照TKR RTPCR kit标准程序进行扩增， 产物为378 bp， 进行10 g/L琼脂糖电泳。

　　1.2.4 Western blot检测A77 1726对IL13促成纤维细胞I型胶原蛋白表达的影响 取生长良好的成纤维细胞， 细胞密度5×108～1×109/L接种于培养瓶中， 无血清培养12～16 h后， 实验分组同1.2.2， 收集细胞， 随后各组用RIPA Buffer将细胞充分裂解， BioRad Dye Reagent（BioRad）进行蛋白定量。调整样品中蛋白质含量， 均以20 μg蛋白量上样进行70 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， 硝酸纤维膜转印。50 g/L脱脂奶粉4℃封闭， TBS洗涤， 经I型胶原蛋白第一抗体和第二抗体分别孵育后， ECL试剂显像。再利用清除缓冲液清除硝纤膜上已结合的一抗和二抗， 重新经βactin一抗、 二抗孵育后， 再次显像， 作为内部参照。对结果利用凝胶定量软件Quantity One(BioRad)进行光密度分析。

　　1.2.5 统计学分析 各实验重复3次， 计量资料以x±s表示， 以t检验对实验组和对照组进行差异显著性检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 A77 1726抑制成纤维细胞生长 不同浓度A77 1726作用成纤维细胞， MTT法检测到A77 1726可抑制成纤维细胞增殖， 当A77 1726浓度在25 μmol/L至100 μmol/L时， 细胞抑制率明显上升。为此， 取50 μmol/L作为A77 1726对成纤维细胞作用的浓度(表1)。

　　表1 不同浓度A77 1726对成纤维细胞生长的影响（略）

　　Tab 1 The effect of A77 1726 on inhibition rate in fibroblasts

　　aP&<0.05，　　bP&<0.01 vs control.

　　2 2 A77 1726阻断IL13促成纤维细胞分泌胶原 羟脯氨酸是胶原分解代谢的产物， 机体内的羟脯氨酸主要存在胶原中， 因此， 羟脯氨酸是反映胶原含量的重要指标。IL13和A77 1726同时作用成纤维细胞24 h后分泌的总胶原含量与单独IL13作用24 h组比较可见减弱， 48 h组可见明显减弱（P&<0.05）， 72 h组减弱最显著（P&<0.01， 图1）。

　　图1 成纤维细胞经A77 1726和IL13共同作用后羟脯氨酸的变化（略）

　　Fig 1 The effect of A77 1726 and IL13 on Hyp production in fibroblasts

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs control.

　　2.3 A77 1726抑制IL13促成纤维细胞I型胶原α1 mRNA表达 RNA提取后， 用RTPCR kit(TaKaRa)进行RTPCR反应， βactin (511 bp)与COL1A1在同一管内扩增， 作为RTPCR的内部参照。反应结束， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳， 结果如图2A所示， IL13对照组以及A77 1726和IL13共同作用实验各组都出现了明显的COL1A1mRNA表达， 即约378 bp处的荧光条带， 通过图像扫描， 积分光密度比值分析， 各实验组COL1A1mRNA表达与对照组比较， 24 h组可见减弱， 48 h组有显著减弱(P&<0.05)， 72 h组减弱最明显（P&<0.01， 图2B）。IL13作用24、 48、 72 h后， 成纤维细胞COL1A1mRNA的表达逐渐增强， 而A77 1726和IL13共同作用24、 48、 72 h后， 成纤维细胞COL1A1mRNA的表达比IL13单独作用组有减弱， 表明A77 1726可抑制IL13促成纤维细胞I型胶原α1 mRNA的表达。

　　图2 A77 1726对IL13促成纤维细胞COL1A1mRNA表达的影响（略）

　　Fig 2 Effects of IL13 and A77 1726 on the expression of COL1A1 mRNA

　　A: Indicates the result of agar gel electrophoresis of RTPCR; 1: DNA marker; 2， 4， 6: IL13 24， 48， 72 h group; 3， 5， 7: IL13+A77 1726 24， 48， 72 h group. B: Indicates the ratio of luminous density of COL1A1 and βactin bands. aP&<0.05， bP&<0.01 vs control.

　　2.4 A77 1726抑制IL13促成纤维细胞I型胶原蛋白表达 IL13(100 μg/L) 和A77 1726（50 μmol/L）作用成纤维细胞不同时间， 裂解细胞提取蛋白质， 进行Western blot实验。结果见图3A为Western blot 的结果， 图3B为各组I型胶原蛋白与βactin条带的光密度比值。结果显示， 各组在蛋白上样量相等， 内参条带基本一致的情况下， 实验各组均出现了I型胶原蛋白条带， 光密度比值分析表明IL13（100 μg/L）和A77 1726（50 μmol/L）作用24 h后， I型胶原蛋白表达可见减弱， 48 h组表达减弱显著增强（P&<0.05）， 72 h组表达减弱最明显（P＜0.01)。IL13作用24 h、 48 h、 72 h后， 成纤维细胞I型胶原蛋白的表达逐渐增强， 加入了A77 1726， 成纤维细胞I型胶原蛋白的表达显著减弱， 说明A77 1726阻断IL13促成纤维细胞I型胶原蛋白的表达。

　　图3 A77 1726对IL13促成纤维细胞I型胶原蛋白表达的影响（略）

　　Fig 3 Effects of IL13 and A77 1726 on the expression of collagen type I protein

　　A: Indicates the result of Western blot; 1， 3， 5: IL13 24， 48， 72 h group; 2， 4， 6: IL13+A77 1726 24， 48， 72 h group. B: Indicates the ratio of luminous density of collagen type I and βactin bands. aP&<0.05， bP&<0.01 vs control.

　　3 讨论
　　
　　我们前期实验结果显示IL13能够促进成纤维细胞的增殖， 作用24 h后即有I型胶原α1mRNA的表达上调， 且持续至72 h， 与文献报道一致［7］。并证实了IL13的该作用是通过将JAK/STAT6信号转导中的转录因子STAT6磷酸化来实现的。本实验将酪氨酸酶抑制剂A77 1726和IL13一起共同作用成纤维细胞， 结果显示: A77 1726和IL13作用48 h后I型前胶原mRNA（COL1A1）在成纤维细胞中表达比IL13单独作用组明显减弱， 作用72 h后几乎达到完全阻断， 这与实验中I型胶原蛋白合成量的变化相符。
　　
　　I型前胶原mRNA是成纤维细胞合成I型前胶原蛋白所必须的翻译模板， 其含量减少， I型前胶原的翻译速度必然下降， 同样条件下I型前胶原合成量减少， 则成纤维细胞分泌I型胶原蛋白下降。因此我们认为A77 1726能通过抑制成纤维细胞内I型前胶原mRNA的转录， 而抑制成纤维细胞合成分泌I型胶原蛋白。推测这种阻断作用的可能原因是: （1）A77 1726抑制成纤维细胞的生长增殖造成分泌细胞总数量减少， 与MTT实验结果相符。我们的实验结果显示A77 1726 25 μmol/L浓度不抑制成纤维细胞生长， 而50 μmol/L浓度可显著抑制成纤维细胞生长， 故选择50 μmol/L作为A77 1726的使用浓度。（2）A77 1726通过抑制IL13信号转导通路中的STAT6的磷酸化， 使之不能形成二聚体进入核内与胶原基因启动子结合， 而抑制胶原基因的转录和翻译。相类似的文献报道有: Si等［8］的研究表明， 用A77 1726预处理肝星状细胞（HSC）可通过阻断3种信号转导通路JAK/STAT通路、 MAPK通路、 PI3K/AKB通路而显著抑制HSC的增殖从而抑制HSC中的I型胶原蛋白的沉积， 阻断肝纤维化进程。另外Yao等［9， 10］的研究显示A77 1726可抑制HSC的增殖和胶原合成， 而抑制由CCl4诱导的大鼠肝纤维化， 其机制可能与其抑制致HSC激活的因子如TGFβ、 TNFα和IL1分泌有关。Akiho等［11］研究表明A77 1726可抑制IL4和IL13诱导下的STAT6的DNA结合活性， 且效果与抗STAT6抗体相同。近期研究表明， IL4和IL13可以显著增强角质细胞HaCaT表面CCL26的产生， 但A77 1726通过抑制JAK1STAT6依赖的通路， 对其增强作用产生阻碍［12］。
　　
　　综上所述， 本研究表明， A77 1726阻断IL13促成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平和蛋白水平的表达， 因此其对纤维化的抑制作用值得进一步研究。

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