【摘要】 目的: 对预变性大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的形态学及免疫组化进行研究， 探讨获取自体激活嗅鞘细胞简单而实用的方法。方法: 建立嗅神经切断模型， 大鼠(12只)均在显微镜下暴露左侧嗅球， 而预变性嗅神经组（6只）切断大鼠左侧嗅神经， 3 d后取材采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅鞘细胞 ， 在不同时间进行NGFRp75 免疫组化染色鉴定及形态学观察。结果: 嗅鞘细胞发生代偿性肥大， 数量及纯度高， 此方法成功培养出自体激活的嗅鞘细胞。结论: 预变性嗅神经是获取成年大鼠自体激活嗅球嗅鞘细胞的简单而实用的方法。
【关键词】 嗅鞘细胞; 预变性; 形态学; 嗅球
已证实成熟的嗅神经与其他中枢神经系统（CNS）不同， 主要区别是能够进行自我更新， 其新生轴突能够长入嗅球形成完整的突触功能联系［1］。主要原因是嗅觉系统含有特殊的神经胶质细胞: 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell， OEC)。OEC是分布于嗅觉系统嗅球和嗅上皮基底膜的一种特殊的胶质细胞。虽然OEC促进中枢神经再生机制不明， 但是已有研究表明OEC分泌许多对神经元有促进作用的营养因子（神经生长因子、 脑源性神经生长因子、 胶质源性神经生长因子、 NTN等）［2］。有研究表明切断嗅神经后再生的嗅神经能够到达嗅球建立突触功能联系， 我们主要探索在切断嗅神经后OEC是否被激活， 以便为临床应用打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
雄性SD大鼠 （12只， 2.5月龄）， 购自西安交通大学动物中心。CO2培养箱（美国 Thermo）、倒置显微镜（厦门Motic）、 培养板、瓶（美国康宁）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、胎牛血清（北京鼎国）、胰酶（Solarbio）、多聚左旋赖氨酸（Sigma）、兔抗大鼠NGFRp75一抗（1∶200， 北京博奥森）、 即用型 SABC 染色试剂盒(武汉博士德) 。
1.2 方法
1.2.1 大鼠嗅神经切断术
雄性SD大鼠， 以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后固定在立体定位仪上， 所有大鼠麻醉后在鼻额缝部位沿头颅正中切开头部皮肤、 皮下软组织及骨膜。显微镜下于鼻额缝后4 mm、 正中缝外侧2 mm处用电钻暴露左侧嗅球， 解剖显微镜下用弯曲的钝性针头沿筛板切断左侧嗅神经 (进入深度约6 mm)［3］。
1.2.2 差速贴壁纯化嗅球嗅鞘细胞
雄性SD大鼠嗅神经切断术3 d后， 显微镜下将左侧嗅球完整取下， 立即放入4℃预冷的DMEM 抗菌素液中(青霉素链霉素各100 U/L)， 并将嗅球被膜剥下， 将嗅球组织在加抗生素的DME液中， 清洗2遍。将嗅球用眼科剪剪碎至1 mm2大小， 2.5 g/L的胰酶在37℃消化15 min 。用含100 mL/L FBS的DF12培养液终止消化5 min室温下800 r/min离心5 min去上清。重新加入100 mL/L FBS的DF12培养液， 用pasteur管轻轻吹打 10～20次并过200目滤网制成单细胞悬液调整密度至1×109/L， 种植于无包被处理的6孔细胞培养板内， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养。按经典Nash差速贴壁法在培养18～36 h 后， 将悬液细胞液吸出， 重新种植于包被多聚赖氨酸的6孔细胞培养板内， 加DFl2 (DMEM∶F12为1∶1) 完全培养液3 mL进行培养。为了便于免疫组化显微镜下观察， 可将多聚赖氨酸处理的盖玻片放入6孔板内， 在盖玻片上进行细胞培养。
1.2.3 形态学研究及免疫组织化学染色鉴定
体外培养嗅鞘细胞主要去除的是成纤维细胞、 星形胶质细胞以及少量的神经元。根据细胞形态不同和成纤维细胞和星形胶质细胞对NGFRp75染色呈阴性反应。选用对嗅鞘细胞特异性染色的NGFRp75结合形态学鉴定嗅鞘细胞及其纯度。差速贴壁后7、 14 d进行鉴定和细胞纯度计算。鉴定前24 h换液1次。细胞爬片首先经0.01 mol/L PBS， pH7.4洗2遍。新鲜配制的40 g/L多聚甲醛室温固定60 min， PBS洗3次， 每次2 min。3 g/L过氧化氢1份+纯甲醇50份， 室温浸泡30 min， 0.01 mol/L PBS洗2次， 每次5 min。2.5 g/L TritonX100 37℃孵育30 min， PBS洗3次， 每次2 min。50 g/L BSA封闭液室温20 min， 吸去多余液体， 不洗。加入适当一抗(兔抗P75NGFR， 1∶200)， 湿盒内4℃下过夜， PBS洗3次， 每次2 min。加入二抗(Biotin标记的羊抗兔IgG)， 37℃孵育20 min， PBS洗3次， 每次2 min。滴加试剂SABC， 37℃孵育20 min， PBS洗4次， 每次5 min。按ABC法进行免疫细胞化学染色， DAB显色镜下观察 ， 随机选取10个视野（0.45 mm2）进行计数P75阳性细性细胞百分率， 观察并比较阳性细胞的形态特征。
2 结果
2.1 预变性嗅神经的嗅鞘细胞形态学
按照18～36 h差速贴壁培养后， 按照18～36 h差速贴壁培养， 在24 h后可见有大量细胞贴壁生长 ， 形态不明显， 可见少量成纤维细胞， 3～5 d嗅鞘细胞大部分为双极、 三极细胞， 与正常组嗅鞘细胞（图1A）比较， 细胞胞体明显大， 突起末端变粗， 透光性差， 折光性好、 立体感强。6～7 d时嗅鞘细胞增殖最快， 数量明显增多， 比正常组嗅鞘细胞增殖提前1～2 d。预变性嗅神经组培养至12 d（图1B）细胞数量继续增加， 可见正常大小的嗅鞘细胞， 但以肥大的嗅鞘细胞为主， 培养14 d成纤维细胞增殖明显。预变性嗅神经的嗅鞘细胞一样具有典型的3种嗅鞘细胞形状: 双极或梭形和扁圆形、 多突起形或油煎蛋形， 主要以梭形和多突起细胞为主。
2.2 预变性嗅神经的嗅鞘细胞免疫组化鉴定及纯度测定
肥大的嗅鞘细胞胞体NGFRp75免疫组化染色强阳性（图2A）， 突起染色较淡， 可见正常大小的嗅鞘细胞和未被染色的成纤维细胞; 而正常组胞体及细丝样突起着色较淡（图2B）。
2.3 细胞根据形态学和细胞免疫组化染色测定嗅鞘细胞纯度
预变性神经组和正常组3～9 d纯度分别95%、 92.5%， 14 d分别为84%和83%。
【摘要】 目的: 对预变性大鼠嗅神经后嗅球嗅鞘细胞的形态学及免疫组化进行研究， 探讨获取自体激活嗅鞘细胞简单而实用的方法。方法: 建立嗅神经切断模型， 大鼠(12只)均在显微镜下暴露左侧嗅球， 而预变性嗅神经组（6只）切断大鼠左侧嗅神经， 3 d后取材采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅鞘细胞 ， 在不同时间进行NGFRp75 免疫组化染色鉴定及形态学观察。结果: 嗅鞘细胞发生代偿性肥大， 数量及纯度高， 此方法成功培养出自体激活的嗅鞘细胞。结论: 预变性嗅神经是获取成年大鼠自体激活嗅球嗅鞘细胞的简单而实用的方法。
【关键词】 嗅鞘细胞; 预变性; 形态学; 嗅球
已证实成熟的嗅神经与其他中枢神经系统（CNS）不同， 主要区别是能够进行自我更新， 其新生轴突能够长入嗅球形成完整的突触功能联系［1］。主要原因是嗅觉系统含有特殊的神经胶质细胞: 嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell， OEC)。OEC是分布于嗅觉系统嗅球和嗅上皮基底膜的一种特殊的胶质细胞。虽然OEC促进中枢神经再生机制不明， 但是已有研究表明OEC分泌许多对神经元有促进作用的营养因子（神经生长因子、 脑源性神经生长因子、 胶质源性神经生长因子、 NTN等）［2］。有研究表明切断嗅神经后再生的嗅神经能够到达嗅球建立突触功能联系， 我们主要探索在切断嗅神经后OEC是否被激活， 以便为临床应用打下基础。
1 材料和方法
1.1 材料
雄性SD大鼠 （12只， 2.5月龄）， 购自西安交通大学动物中心。CO2培养箱（美国 Thermo）、倒置显微镜（厦门Motic）、 培养板、瓶（美国康宁）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、胎牛血清（北京鼎国）、胰酶（Solarbio）、多聚左旋赖氨酸（Sigma）、兔抗大鼠NGFRp75一抗（1∶200， 北京博奥森）、 即用型 SABC 染色试剂盒(武汉博士德) 。
1.2 方法
1.2.1 大鼠嗅神经切断术
雄性SD大鼠， 以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后固定在立体定位仪上， 所有大鼠麻醉后在鼻额缝部位沿头颅正中切开头部皮肤、 皮下软组织及骨膜。显微镜下于鼻额缝后4 mm、 正中缝外侧2 mm处用电钻暴露左侧嗅球， 解剖显微镜下用弯曲的钝性针头沿筛板切断左侧嗅神经 (进入深度约6 mm)［3］。
1.2.2 差速贴壁纯化嗅球嗅鞘细胞
雄性SD大鼠嗅神经切断术3 d后， 显微镜下将左侧嗅球完整取下， 立即放入4℃预冷的DMEM 抗菌素液中(青霉素链霉素各100 U/L)， 并将嗅球被膜剥下， 将嗅球组织在加抗生素的DME液中， 清洗2遍。将嗅球用眼科剪剪碎至1 mm2大小， 2.5 g/L的胰酶在37℃消化15 min 。用含100 mL/L FBS的DF12培养液终止消化5 min室温下800 r/min离心5 min去上清。重新加入100 mL/L FBS的DF12培养液， 用pasteur管轻轻吹打 10～20次并过200目滤网制成单细胞悬液调整密度至1×109/L， 种植于无包被处理的6孔细胞培养板内， 置于37℃、 50 mL/L CO2培养箱内培养。按经典Nash差速贴壁法在培养18～36 h 后， 将悬液细胞液吸出， 重新种植于包被多聚赖氨酸的6孔细胞培养板内， 加DFl2 (DMEM∶F12为1∶1) 完全培养液3 mL进行培养。为了便于免疫组化显微镜下观察， 可将多聚赖氨酸处理的盖玻片放入6孔板内， 在盖玻片上进行细胞培养。
1.2.3 形态学研究及免疫组织化学染色鉴定
体外培养嗅鞘细胞主要去除的是成纤维细胞、 星形胶质细胞以及少量的神经元。根据细胞形态不同和成纤维细胞和星形胶质细胞对NGFRp75染色呈阴性反应。选用对嗅鞘细胞特异性染色的NGFRp75结合形态学鉴定嗅鞘细胞及其纯度。差速贴壁后7、 14 d进行鉴定和细胞纯度计算。鉴定前24 h换液1次。细胞爬片首先经0.01 mol/L PBS， pH7.4洗2遍。新鲜配制的40 g/L多聚甲醛室温固定60 min， PBS洗3次， 每次2 min。3 g/L过氧化氢1份+纯甲醇50份， 室温浸泡30 min， 0.01 mol/L PBS洗2次， 每次5 min。2.5 g/L TritonX100 37℃孵育30 min， PBS洗3次， 每次2 min。50 g/L BSA封闭液室温20 min， 吸去多余液体， 不洗。加入适当一抗(兔抗P75NGFR， 1∶200)， 湿盒内4℃下过夜， PBS洗3次， 每次2 min。加入二抗(Biotin标记的羊抗兔IgG)， 37℃孵育20 min， PBS洗3次， 每次2 min。滴加试剂SABC， 37℃孵育20 min， PBS洗4次， 每次5 min。按ABC法进行免疫细胞化学染色， DAB显色镜下观察 ， 随机选取10个视野（0.45 mm2）进行计数P75阳性细性细胞百分率， 观察并比较阳性细胞的形态特征。
2 结果
2.1 预变性嗅神经的嗅鞘细胞形态学
按照18～36 h差速贴壁培养后， 按照18～36 h差速贴壁培养， 在24 h后可见有大量细胞贴壁生长 ， 形态不明显， 可见少量成纤维细胞， 3～5 d嗅鞘细胞大部分为双极、 三极细胞， 与正常组嗅鞘细胞（图1A）比较， 细胞胞体明显大， 突起末端变粗， 透光性差， 折光性好、 立体感强。6～7 d时嗅鞘细胞增殖最快， 数量明显增多， 比正常组嗅鞘细胞增殖提前1～2 d。预变性嗅神经组培养至12 d（图1B）细胞数量继续增加， 可见正常大小的嗅鞘细胞， 但以肥大的嗅鞘细胞为主， 培养14 d成纤维细胞增殖明显。预变性嗅神经的嗅鞘细胞一样具有典型的3种嗅鞘细胞形状: 双极或梭形和扁圆形、 多突起形或油煎蛋形， 主要以梭形和多突起细胞为主。
2.2 预变性嗅神经的嗅鞘细胞免疫组化鉴定及纯度测定
肥大的嗅鞘细胞胞体NGFRp75免疫组化染色强阳性（图2A）， 突起染色较淡， 可见正常大小的嗅鞘细胞和未被染色的成纤维细胞; 而正常组胞体及细丝样突起着色较淡（图2B）。
2.3 细胞根据形态学和细胞免疫组化染色测定嗅鞘细胞纯度
预变性神经组和正常组3～9 d纯度分别95%、 92.5%， 14 d分别为84%和83%。
3 讨论
在外周神经， 已有学者用预损伤方法， 证实雪旺细胞分泌功能、 活力和增殖增强［4， 5］。有些学者从乳鼠中取材， 所获得的OEC也可有较强的增殖能力， 而且不需要预变性， 细胞纯度较高， 然而这种来源的OEC因为没有受到嗅神经损伤的刺激， 可能其功能远没有来源于预变性神经的细胞旺盛。OEC的功能对嗅神经损伤后的修复有着重要的意义， 来源于完整神经OEC的这一不足， 也将影响其在组织工程及神经再生研究方面的应用。
对于成年大鼠， 嗅神经预损伤后需3～4 d变性达到高峰［6］， 此时损伤神经远端轴突已被吞噬溃变， 成纤维细胞还未大量增殖， 而OEC已被激活， 因此此时是获取OEC的最佳时间。本方法与其他方法不同点主要在于: 细胞来源于预损伤颅内嗅神经后嗅球， 取材时应用显微外科技术剥离外膜， 减少了成纤维细胞等其他细胞的来源， 利于提高OEC的纯度; 分离培养时经过差速贴壁除去成纤维细胞， 在以后的培养过程中没有应用抗成纤维细胞生长的药物。通过显微镜下观察及p75标记， 鉴定了这种细胞确为OEC， 纯度高， 并发生反应性OEC， 细胞胞体肥大， 突起末端粗， 这种变化与预变性嗅神经有着密切的关系， 早就有证据表明OEC具有分泌许多对神经元有促进作用的营养因子， 细胞肥大可能由这种功能的增强。另外OEC还具有免疫功能， 即OEC具有吞噬轴突碎片的功能［7］， 嗅神经切断可能激活OEC的吞噬轴突碎片功能， 而使OEC发生肥大， 再者星形胶质细胞胞突与OEC相互作用， 在损伤部位中形成一个通道， 以便再生的轴突通过， 从而进一步产生功能性连接， OEC这种功能也被激活［8］。由此可见反应性OEC对再生神经元有利的。通过本方法所培养的OEC为自体激活的OEC， 为神经组织工程研究中OEC的来源提供了一个有效的方法。
参考文献
［1］Graziadei PP， Graziadei GA. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals.I.Morphological aspects of differentiation and s tructural organization of the olfactory sensory neurons［J］. J Neurocytol， 1979， 8(1): 1-18.
［2］Woodhall E， West AK， Chuah MI. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor， brainderived neurotrophic factor， glia cell linederived neurotrophic factor and their receptors［J］. Molecular Brain Research， 2001， 88(1-2): 203-213.
［3］苗旭涛， 魏永祥. 外伤性嗅觉障碍大鼠嗅黏膜的组织学变化［J］. 中国耳鼻咽喉头颈外科， 2007， 14(1): 57-61.
［4］冯世庆， 周先虎， 孔晓红， 等. 自体激活雪旺细胞移植治疗急性脊髓损伤的实验研究［J］. 中华骨科杂志， 2006， 26(8): 553-557.
［5］Kohama I， Lankford KL， Preiningerova J， et al. Transplantation of cryopreserved adult human Schwann cells enhances axonal conduction in demyelinated spinal cord［J］. J Neurosci， 2001， 21(3): 944-950.
［6］Graziadei PPC， Montigraziadei GA. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals.III. Deafferentation and reinnervation of the olfactory bulb following section of the fila olfactoria in rat［J］. J Neurocytol， 1980， 9(2): 145-162.
［7］Wewetzer K， Kern N， Ebel C， et al. Phagocytosis of O4+ axonal fragments in vitro by p75neonatal rat olfactory ensheathing cells［J］.Glia， 2005， 49(4): 577-587.
［8］Li Y， Li D， Raisman G.Interaction of olfactory ensheathing cells with astrocytes may be the key to repair of tract injuries in the spinal cord: the pathway hypothesis’［J］. J Neurocyto， 2005， 34(3-5): 343-351.