可溶性Jagged1/Fc融合蛋白对CD4+ CD25+T细胞分化的作用

【摘要】 　　目的: 探讨可溶性Jagged1/Fc融合蛋白对小鼠淋巴细胞CD4+ CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Tr)分化的作用。方法:利用荧光标记的单克隆抗体(mAb)双染技术结合流式细胞术(FCM)观察不同时间Jagged1/Fc融合蛋白及不同浓度Jagged1Notch信号通路抑制剂DAPT对小鼠淋巴细胞表面分子CD4和CD25表达的影响。通过Luminex蛋白液相芯片技术检测Jagged1/Fc作用下T细胞培养上清中白细胞介素4（IL4）、 干扰素γ（IFNγ）和转化生长因子β（TGFβ）的表达水平。结果: 浓度为1000 μg/L时， Jagged1/Fc在第1、3、5天均能增强淋巴细胞表面CD4， CD25的表达， 以第3天的增强作用最为明显（P&<0.01）; DAPT浓度从2μmol/L逐渐增至16 μmol/L时， 对CD4、CD25表达的抑制作用逐渐增强， 以16 μmol/L DAPT的抑制作用最为明显， 呈剂量依赖关系（P&<0.01， r=0.96）， 而Jagged1/Fc能够逆转DAPT对CD4， CD25表达的抑制; Jagged1/Fc能够促进淋巴细胞培养上清中TGFβ表（P&<0.01）。结论: 可溶性Jagged1/Fc融合蛋白可能参与诱导小鼠淋巴细胞向CD4+ CD25+ Tr分化。

【关键词】 Jagged1/Fc融合蛋白; 淋巴细胞; 调节性T细胞; 小鼠

　　Jagged1 (又被命名为CD339)［1］是细胞膜上Notch受体的主要配体之一， 表达于骨髓、 胎儿肝基质细胞和胸腺上皮细胞等多种组织， 参与调控许多组织的生长发育。有研究发现， 过表达Jagged1的树突状细胞(dendritic cells， DC)能够诱导CD4+ T 细胞向调节性T细胞1(regulatory T cell 1， Tr1) 、 辅助性T细胞3(helper Tcell3， Th3或Th3分化， 从而介导免疫耐受［2-5］。这些结果提示Jagged1在免疫调节中具有重要作用。与以往采用Jagged1表达载体导入细胞或与固有表达Jagged1的细胞共培养的手段不同， 本研究直接利用可溶性大鼠的Jagged1胞外段与人IgG1 Fc段的融合蛋白， 即Jagged1/Fc融合蛋白来探讨其对CD4+CD25+T细胞的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　雄性清洁级BALB/c小鼠（8周龄， 体质量18～22 g）， 购自广东省医学实验动物中心。L谷氨酰胺、β巯基乙醇、γ分泌酶抑制剂DAPT均购自美国Sigma公司; RPMI1640和胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）为美国Gibco BRL公司产品; Jagged1/Fc 融合蛋白购自R&&D Systems公司; 白细胞介素2（IL2）购自英国Peprotech公司; 兔来源的antiCD4PE和antiCD25FITC购自美国eBioscience公司; 流式细胞仪（FACSCalibur型）购自美国Becton Dickinson公司。

　　1．2 方法

　　1.2.1 淋巴结细胞悬液的制备

　　将BALB/c小鼠机械横断颈髓处死， 无菌分离双侧腋窝、锁骨下、腹股沟浅表淋巴结和肠系膜淋巴结， 去掉被膜， 机械研磨， 于200目不锈钢网筛过滤。收集细胞， 用冷PBS离心（300 g， 5 min）洗涤细胞2次后， 细胞重悬于RPMI1640完全培养液中， 调整细胞密度为2×109/L。

　　1.2.2 双色荧光抗体标记分析CD4和CD25的表达

　　淋巴结细胞悬液接种于24孔细胞培养板上， 每孔1 mL， 设为1 000 μg/L Jagged1/Fc和淋巴细胞空白对照组， 加入Jagged1/Fc后在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育。分别于0、 1、3、5 d离心收集细胞（300 g， 5 min）， 加入兔来源的antiCD4PE和antiCD25FITC各1.0 μg， 混匀后4℃下避光放置30 min。经PBS洗涤两次后（300 g， 5 min）， 流式细胞仪检测与分析。
　　
　　另取淋巴结细胞悬液接种于24孔细胞培养板上， 每孔1 mL， 设为2、4、8、16 μmol/L DAPT组、16μmol/L DAPT+1 000 μg/L Jagged1/Fc及淋巴细胞空白对照组。同时加入DAPT及Jagged1/Fc， 在37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育3 d后离心收集细胞， 按上述方法染色。

　　1.2.3 FCM检测与分析

　　所得数据经FACS Calibur流式细胞仪和Cell Quest 软件获取。在前散射（FSC）对侧散射（SSC）二维散点图中划出淋巴细胞区R1， 然后对淋巴细胞F ITC和PE荧光强度进行检测。其中FITC为荧光1 (FL1) ， PE为荧光2 (FL2) 。每管样品检测10 000 个细胞， 所获数据用CellQuest软件分析。

　　1.2.4 LuminexTM100检测

　　在PVDF膜96孔板中依次加入50 μL RPMI1640（空白孔）、 以 RPMI1640培养液倍比稀释的标准品和样本上清， 然后每孔加入分别能与IL4、IFNγ、TGFβ结合的3种微珠混合物， 避光振荡孵育2h。将板置于真空架上， 液体经孔底部PVDF膜被去除， 加入75μL分析缓冲液重悬微球， 并加入25μL 生物素标记的抗以上各种细胞因子的兔来源的抗体混合物， 避光振荡孵育2h， 后加入25μL StreptavidinPE 继续孵育30 min， 最后加入25μL终止液孵育5min， 除去各孔液体。以125μL分析缓冲液重悬微珠， 用LuminexTM100蛋白液相分析仪检测， 应用MasterPlexTM QT多元数据分析软件绘制标准曲线， 并计算出每个样品所含的3种细胞因子的浓度。

　　1.2.5 统计学分析

　　实验结果用统计软件包SPSS10.0 for Windows进行处理， 数据以x±s表示， 多组间相比采用OnewayANOVA， 两组间比较用Student’s ttest和Bivariate correlation。

　　2 结果

　　2.1 不同时间Jagged1/Fc对淋巴细胞CD4和CD25表达的影响
　　初始淋巴细胞少量表达CD4和CD25， 随着时间从1d逐渐增至5 d， 对照组和Jagged1/Fc组CD4+ CD25+细胞百分比都逐渐增高， 且Jagged1组增高更明显， 与对照组相比有统计学意义（P&<0.05）; 其中以第3天Jagged1组增高最明显（P&<0.01， 图1）。以上结果提示， Jagged1能增强淋巴细胞表面CD4和CD25的表达， 且以第3 天的增强作用最明显。

　　2.2 Jagged1Notch信号通路抑制剂对淋巴细胞CD4和CD25表达的影响

　　DAPT浓度从2μmol/L逐渐增至16μmol/L时， CD4+ CD25+细胞百分比逐渐降低， 以16μmol/LDAPT组降低最明显， 呈剂量依赖关系（P&<0.01， r=0.96）; 而Jagged1/Fc +DAPT组CD4+ CD25+细胞百分比明显高于同剂量DAPT组（P&<0.01， 图2）。提示抑制Jagged1Notch信号通路能够抑制小鼠细胞CD4和CD25的表达水平， 而Jagged1/Fc能够逆转DAPT的抑制作用。

　　2.3 Jagged1/Fc 对淋巴细胞分泌细胞因子TGFβ的影响
　　淋巴细胞中刚加入Jagged1/Fc、Jagged1/Fc +DAPT后， 其上清中TGFβ水平无明显差异（P&>0.05）， 作用24h后， Jagged1/Fc和Jagged1/Fc +DAPT组TGFβ水平明显增高， 与对照组相比有统计学意义（P&<0.05）， 同时Jagged1/Fc组CD4+ CD25+细胞百分比明显高于对照组（图3A， 图3B）。结果提示: Jagged1/Fc作用下CD4+CD25+Tr的上调可能与TGFβ的水平升高有关。

　　3 讨论

　　Jagged1为单次跨膜蛋白， 在抗原提呈细胞（APC）如DCs、 B细胞和巨噬细胞表面表达丰富， 介导DCs成熟和分化， 在免疫应答中发挥重要作用［6］。Hoyne等［2］将室内尘埃螨负载的Jagged1 APC注入小鼠体内后发现， Jagged1 DC可能诱导初始CD4+T细胞分化成对此抗原特异性的Tr。这些Tr能够抑制初次和二次免疫应答， 并过继转移抗原特异性免疫耐受。Vigouroux等［3］用过表达Jagged1 EB病毒阳性的人淋巴母细胞作为APC与已经感染过EB病毒的人外周血单个核细胞进行混合淋巴细胞培养， 结果显示， 过表达Jagged1能够刺激记忆性CD4+ T细胞分化为能分泌高水平IL10的Trl细胞， 从而抑制再次免疫应答。Yvon等［5］发现过表达Jagged1的EBVLCL刺激的CD45RA+ T细胞能够分化为产生高水平TGFβ的TH3细胞， 并抑制初次免疫应答。CD4+CD25+Tr主要控制对自体和外来抗原的免疫反应。研究发现， 天然CD4+CD25+Tr表达高水平Notch信号的转录调节因子Dehex和HES1; 并且接受刺激后， CD4+CD25+Tr表达Notch4和Delta1(Notch的另一配体)的水平明显高于CD4+CD25-T细胞， 提示Notch信号通路可能参与CD4+CD25+Tr的分化［7］。但是关于Jagged1Notch信号通路对CD4+CD25+Tr分化的作用还未见报道。本研究利用 Jagged1/Fc融合蛋白直接作用于小鼠淋巴细胞， 发现Jagged1/Fc组小鼠CD4+ CD25+T细胞数量明显高于对照组， 且Jagged1/Fc能够逆转Jagged1Notch信号通路抑制剂DAPT对CD4+ CD25+T细胞的下调， 提示Jagged1/Fc可能参与诱导小鼠淋巴细胞向CD4+ CD25+ Tr分化。

　　CD4+CD25+Tr活化后分泌 TGFβ、IL10， 表达CD25( IL2Rα)、叉头蛋白( FOXP3 蛋白) 及细胞毒性T 淋巴细胞抗原4(CTLA4) 分子等， 通过细胞间直接接触或细胞因子间接方式广泛参与自身免疫耐受、肿瘤免疫、移植免疫。本研究中， Jagged1/Fc融合蛋白作用后的小鼠淋巴细胞上清中TGFβ水平明显高于对照组（P&<0.05）， 提示Jagged1/Fc作用下CD4+CD25+Tr的上调可能与TGFβ的水平升高有关， 但具体机制还需进一步探讨。

参考文献

　　［1］徐竹蔚， 金伯泉. 新的人类白细胞分化抗原(CD)的命名及其功能［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2005， 21(3): 395-397.

　　［2］Hoyne GF， Le Roux I， CorsinJimenez M， et al. Serrate1induced notch signalling regulates the decision between immunity and tolerance made by peripheral CD4+ T cells［J］. Int Immunol， 2000， 12(2): 177-185.

　　［3］Vigouroux S， Yvon E， Wagner HJ， et al. Induction of antigenspecific regulatory T cells following overexpression of a Notch ligand by human B lymphocytes［J］. J Virol， 2003， 77: 10872-10880.

　　［4］Yvon ES， Vigouroux S， Rousseau RF， et al. Overexpression of the Notch ligand， Jagged1， induces alloantigenspecific human regulatory T cells［J］. Blood， 2003， 102(10): 3815-3821.

　　［5］Alrssen D， Blander JM， Lee GR， et al. Instruction of distinct CD4 T helper cell fates by diferent Notch hgands on antigen presenting cells［J］. Cell， 2004， 117(4): 515-526.

　　［6］Yamaguchi E， Chiba S， Kumano K， et al. Expression of Notch ligands， Jagged1， 2 and Delta1 in antigen presenting cells in mice［J］. Immunology Letters， 2002， 81(5): 59-64.

　　［7］Ng WF， Duggan PJ， Ponchel F， et al. Human CD4+ CD25+ cells: a naturally occurring population of regulatory T cells［J］. Blood， 2001， 98(9): 2736-2744.