Alzheimer患者血清中抗Aβ42自身抗体的纯化及鉴定

　　 作者：段金海， 徐书雯， 莫建伟， 向绍通， 方运勇， 汪华侨， 莫思杰， 胡涛， 姚志彬

【摘要】 　　目的: 纯化并鉴定阿尔茨海默病（AD）患者血清中抗Aβ42自身抗体。方法: 选择AD患者做为研究对象， 采集血清标本， 测定抗体含量， 用饱和硫酸铵沉淀血清得到IgG粗品， Aβ42免疫亲和柱层析对粗品IgG进一步分离纯化， 采用PAGE电泳和Western blot方法鉴定IgG纯度和免疫活性。结果: 用CNBr活化Sephrose 4B柱层析纯化出较高纯度的抗Aβ42自身抗体， 纯度可达到90%。结论: CNBr活化Sephrose 4B层析柱可有效地从人血清中纯化出较高纯度的抗Aβ42自身抗体， 便于对自身抗体进一步研究， 为AD的免疫治疗提供更多的信息。

【关键词】 阿尔茨海默病; 自身抗体; 血清

　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease， AD）是以进行性加重的记忆认知功能减退为主要临床特点的中枢神经系统退行性z疾病， 主要病理特征为老年斑(senile plaques， SPs)及神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles， NFTs）。β淀粉样蛋白（amyloid βpeptide， Aβ）具有神经毒性， 其在脑内的生成增多及异常聚集是AD发病的关键因素［1］。研究认为Aβ在体内可以诱导出抗Aβ自身抗体， 因为从人免疫球蛋白可以分离出抗Aβ自身抗体［2］， 并且可从人类B细胞克隆出Aβ抗体［3］。流行病学调查也发现， 与正常人相比AD患者的血清和脑脊液含有低滴度的Aβ自身抗体［4］。虽然目前有小样本试验用含抗Aβ自身抗体的静脉用免疫球蛋白治疗AD［5］， 但是这些自身抗体的病理生理作用仍然不清楚。在AD 转基因鼠和Ⅰ期临床试验中， Aβ1 - 42疫苗可以诱导出特异性的Aβ42抗体， 并显示出良好的免疫原性和安全性， 但在Ⅱa 期临床试验(AN1792) 中， 6%的受试者出现了无菌性脑膜脑炎［6］。目前认为， 脑炎的发生与Aβ1- 42全肽及佐剂QS21 导致的Th1 细胞免疫反应有关。为进一步阐明AD患者体内自身抗体的免疫特性及临床价值， 本课题组对自身抗体进行分离纯化分析， 希望对AD的免疫治疗研究有所帮助。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象 随机选取2004-04/2008-03在广东省南海福利中心和广东省人民医院东病区神经内科住院的轻至中度AD患者50(男36， 女14)例; 年龄60～80岁， 年龄平均(65.2±8.6)岁， 病程2～5年， 符合美国国立神经病学传染病及卒中研究所与AD和相关病协会（NINCDSADRDA）的诊断标准。所有患者均由两位神经内科医师做出诊断且患者视、 听力及精神状态允许合作完成神经心理学测试。简易精神状态量表［MMSE， (13±4.51)分; 8～22分］及日常活动量表［ADL（30.6±3.4） 分; 25～34分］评价患者认知行为功能状态， Loeb改良缺血量表评分均小于4分。受教育程度: 文盲4例， 小学4例， 中学以上学历8例。所有研究对像均为右利手， 均排除高血压、 糖尿病、 精神病史、 酒精或药物滥用、 肿瘤及自身免疫性疾病等。

　　1.2 材料 Aβ42为Sigma公司产品， Aβ42单克隆抗体(mAb)8G7为Calbiochem公司产品。96孔聚苯乙烯反应板为Greiner公司产品， HRP羊抗小鼠IgG为博士德公司产品， 预染Marker为Invitrogen公司产品。PVDF膜为Biotech公司产品， 标准品GSTAβ42由中山大学分子中心实验室的张革老师提供。电泳仪及转印系统为BioRad公司产品。CNBractivated Sepharose 4B为GE Healthcare公司产品。

　　1.3 方法

　　1.3.1 血清标本的收集和处理 清晨空腹采血， 装入无菌试管， 不加抗凝剂， 室温静置30 min后， 4℃， 1 000 g离心10 min。上清分装入另外一支无菌管， -70℃保存。

　　1.3.2 间接ELISA 采用间接ELISA检测［7］， Aβ42（10 μg/孔）包被96孔聚苯乙烯反应板， 每孔100 μL， 4℃孵育过夜。30 mL/L小牛血清37℃封闭2 h。 加入倍比稀释的血清样品（从1∶10开始稀释）。 过氧化物酶标记山羊抗人IgG， 1∶2 000稀释， 每孔100 μL， 37℃孵育40 min， 洗涤。TMB显色， 2 mol/L h3SO4 50 μL中止， 于波长450 nm下测定每孔A值， 以样本孔吸收值比空白孔吸收值之比大于2.1为阳性。mAb 8G7作为阳性对照， 建立标准曲线。

　　1.3.3 抗体纯化 33%和50%饱和硫酸铵盐析: 按常规方法进行［8］。 溴化氰(CNBr)活化的Sephrose 4B柱层析: 按试剂说明书操作， 即取1.5 g CNBractivated Sephrose 4B 冻干粉， 溶胀、 重悬后， 与4 mg的Aβ42蛋白混合， 封闭、 洗涤后装柱。以50 mL PBS(pH7.4)平衡柱(流速， 60 mL/h) ， 加入盐析的粗提的IgG， 用洗脱液（50 mmol/L HCl甘氨酸缓冲液， pH分别为2.5和1.5交替进行）洗脱， 出峰时收集流出的组分， 用碳酸盐缓冲液调节pH至中性， 透析48 h， 于4℃保存。纯化效果采用15 g/L SDSPAGE进行分析。

　　1.3.4 Western blot检测 参照李少兵等［9］的方法， 标准品为GSTAβ42融合蛋白， 相对分子质量(Mr) 约为30 000。加样时， 每孔10 μL (含Aβ42 20 μg) ， 恒压120 V电泳。卸胶、 清洗及装架后， 恒流50 mA电转90 min。取出PVDF膜经双蒸水洗涤、 30 mL/L BSA封闭和TBST洗涤后， 依次加入1∶100纯化的样品和1∶2 000的HRP羊抗人IgG， 室温孵育2 h， 上述两步后分别用TBST洗涤5次， 时间分别为1、 2、 3、 4、 5 min。DAB显色。以小鼠抗人Aβ42 mAb(8G7)作为阳性对照。

　　1.3.5 统计学分析 全部数据采用SPSS11.0分析。

　　2 结果

　　2.1 间接ELISA 结果发现AD患者血清中都出现抗Aβ42自身抗体， 抗体浓度在（32.1±8.2） mg/L， 范围为23～49 mg/L。AD的抗体浓度与性别、 棠炅浼癕MSE评分都没有相关关系。

　　2.2 亲和纯化 以CNBractivated Sepharose 4B层析柱纯化的人抗Aβ42自身抗体进行SDSPAGE分析， 结果显示相对分子质量（Mr）在55 000和25 000有2条清晰的条谱带分别为轻、 重链的特异条带， 纯度可达90%(图1)。

　　图1 纯化的人抗Aβ42自身抗体进行SDSPAGE分析（略）

　　2．3 Western blot分析 AD患者的纯化Aβ42自身抗体及小鼠抗人Aβ42 mAb在Mr为30 000处有蛋白结合带， 与GST Aβ42融合蛋白质的结合位置相符合（图2）。

　　图2 Western blot方法检测纯化的人抗Aβ42自身抗体的特异性(DAB显色)（略）

　　1: 小鼠抗人Aβ42 mAb; 2: 抗Aβ42自身抗体.

　　3 讨论
　　
　　研究发现， AD患者血清中含有低滴度的抗Aβ自身抗体， 与成熟的老年斑结合能力下降， 对PC12细胞的保护作用也较健康老人下降， 因此认为AD患者体内可能存在着的针对Aβ42的免疫耐受［10］。与以往结果相似， 本研究显示AD患者的抗体含量与性别、 棠炅浼癕MSE评分没有相关性［2］。虽然随着年龄的增加， 老年人的免疫反应呈下降的趋势， 但AD患者Aβ自身抗体含量的降低与老年人总体免疫反应水平下降无相关性［11］。因此这些结果提示， Aβ自身抗体的降低是AD患者特有的免疫低反应性。Monsonego等［12］也发现用Aβ肽接种APP转基因鼠及AD患者的T淋巴细胞， Aβ肽诱导的T淋巴细胞增殖反应较野生鼠明显降低， 而且在转基因鼠诱导出的Aβ抗体水平明显低于野生鼠， 认为这可能是由于T细胞对Aβ肽产生耐受， 导致对B细胞的辅助作用下降， 不足以产生足够和有效的抗体以清除体内的Aβ， 从而导致老年斑的形成。为进一步研究自身抗体的病理生理作用， 本研究用亲和纯化法纯化抗体， 以便对其进一步研究从而揭示其作用机制。
　　
　　饱和硫酸铵盐析法是抗体分离纯化中最常用的技术之一， 具有溶解度大、 对温度不敏感、 分离效果好、 对抗体有稳定结构等优点。本研究中采用50%和33%的饱和硫酸铵沉淀蛋白的两个临界点， 以去除血清中大量的纤维蛋白和白蛋白等杂蛋白， 为CNBractivated Sephrose 4B的进一步亲和纯化， 提供了较纯的样品， 同时也节约了亲和纯化的杂蛋白洗脱、 目的的蛋白洗脱以及柱子再生平衡时间， 使样品的活性、 纯度得到保证， 柱子不会因长时间使用而受至影响， 可延长柱子的使用寿命。结果发现CNBractivated Sephrose 4B亲和柱可纯化血清抗Aβ自身抗体， 得到了足够量的纯IgG， Western blot检测证明有较高的特异性。
　　
　　综上所述， 本研究首次探讨了血清抗Aβ自身抗体的纯化方法， 得到了一定量的具有高纯度、 袒钚院玫目笰β自身抗体。AD免疫治疗是目前AD治疗研究的热点之一， 抗体通过Fc片段的受体介导的单核/小胶质细胞吞噬作用来清除Aβ， 也可介导淀粉样蛋白纤维解聚， 或通过“周围降解作用”改变脑内Aβ的动态平衡， 减轻体内过多的Aβ， 显示了免疫治疗的有效性， 但同时导致无菌性脑膜脑炎［5］。因此， 研究如何避免激活脑内细胞免疫反应成为AD疫苗研制的主要方向。对AD外周血中的抗Aβ抗体纯化， 便于对其进一步研究， 对其生理及病理机制的进一步研究不仅有助于探索AD的发病机制， 对于AD免疫治疗的进一步开发避免其副作用也会提供一定的帮助。

参考文献

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