TWEAK诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成MMP3的实验研究

　　　　作者：夏丽萍， 肖卫国*， 李俊松， 丁爽， 鲁静

【摘要】 　　目的: 通过观察TWEAK在不同浓度下对RA FLS诱导合成MMP3的影响， 探讨TWEAK参与类风湿关节炎(RA)关节骨及软骨破坏的相关机制， 进而寻求治疗RA的新途径。方法: 将rhTWEAK与成纤维样滑膜细胞（FLS）共培养， 应用ELISA法检测细胞培养液中MMP3水平; 用反转录聚合酶反应（RTPCR）检测FLS中MMP3 mRNA的表达水平。结果: TWEAK终浓度为50、 100 μg/L组诱导RA FLS合成MMP3的水平明显高于对照组， 具有显著的统计学意义（P&<0.05）; TWEAK终浓度为100 μg/L诱导RA FLS的MMP3 mRNA表达水平为对照组的1.26倍， 具有显著的统计学意义（P&<0.05）; TNFα和IL1β对TWEAK诱导RA FLS合成MMP3及MMP3 mRNA表达具有协同作用， 协同作用组MMP3的水平及MMP3mRNA表达水平明显高于单纯TWEAK组， 具有显著的统计学意义（P&<0.05）。结论: TWEAK通过诱导RA FLS合成MMP3， 直接参与RA的关节损伤， TNFα和IL1β在此过程中发挥协同作用。

【关键词】 关节炎; 类风湿; TWEAK; 成纤维样滑膜细胞; 基质金属蛋白酶3　

　　［Abstract］ AIM: To investigate the effects of TWEAK on the synthesis of MMP3 in RA FLS at different concentrations and to discuss the relative mechanism of how TWEAK involves in the destruction of articular bone and cartilage. METHODS: RA FLS were primarily cultured and stimulated with TWEAK. ELISA was used to detect the concentration of MMP3 in cellcultured fluid. The gene mRNA expression of MMP3 was measured by RTPCR. RESULTS: The level of MMP3 induced by TWEAK at 50 and 100 μg/L was higher than that in control group， which had significant statistic difference（P&<0.05）.The expression level of MMP3mRNA induced by TWEAK at 100 μg/L was 1.26 times higher than that in the control group， which had significant statistic difference（P&<0.05）.TNFα and IL1β had synergetic effect on the synthesis and mRNA expression of MMP3. The level in the synergetic group was significantly higher than that in the simple TWEAK group ， which had significant statistic difference（P&<0.05）. CONCLUSION: TWEAK can induce RA FLS to synthesize MMP3 and damage the articular bone and cartilage directly. TNFα， IL1β and TWEAK had synergetic effects during the synthesis of MMP3 in RA FLS.

　　［Keywords］arthritis; rheumatoid; TWEAK; fibroblastslike synoviocyte; Matrix metalloproteinases 3

　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病， 其病因及发病机制尚未完全明确。但大量研究证实: 成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocytes， FLS)在RA发病过程中处于异常活跃状态， 分泌大量促炎性细胞因子 、 趋化因子和金属蛋白酶， 引发滑膜炎症反应、 软骨基质的崩解［1］。肿瘤坏死因子样凋亡的微弱诱导剂 (tumor necrosis factorlike weak inducer of apoptosis， TWEAK)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)配体超家族的新成员， 具有促进多种细胞因子分泌、 诱导内皮细胞增生和血管生成等作用［2］， 在RA的发生、 发展中所起的核心作用备受关注［3］。本研究旨在通过观察TWEAK在不同浓度下对RA FLS诱导合成MMP3的影响， 探讨TWEAK参与RA关节骨及软骨破坏的相关机制， 进而寻求治疗RA的新途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 滑膜组织取材于中国医科大学附属第一医院骨科， 经关节镜行膝关节置换或滑膜切除术的患者， 诊断均符合1987年美国风湿病学会（ARA）修订的类风湿关节炎的分类标准。FITC鼠抗人CD14单克隆抗体（mAb）及其同型阴性对照mAb购自深圳晶美公司。FITC鼠抗人CD68 mAb及其同型阴性对照mAb购自Serotec公司。鼠抗人波形纤维蛋白（Vimentin）mAb购自Sigma公司。免疫组化试剂盒购自Zymed公司。重组人TWEAK、 TNFα、 IL1β购自Peprotech公司。MMP3ELISA试剂盒购自R&&D公司。RTPCR试剂盒购自大连宝生物TaKaRa公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 FLS的分离、 鉴定、 培养 无菌获取关节镜术切除的RA患者滑膜组织， 尽量剔除脂肪及纤维组织， 无菌PBS冲洗2～3遍， 反复剪切成细小组织块， 置于无菌培养皿中， 加入2 g/L的胶原酶Ⅲ 37℃消化24 h， 200目纱网过滤后， 离心， 去除脂肪及杂质， 加入含100 mL/L小牛血清(含青霉素、 链霉素)的DMEM， 分装于培养瓶内， 置于37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养24 h后， 更换培养液， 待滑膜细胞80％汇合成片， 按1∶3的比例消化传代， 实验用3～7代细胞。FLS的鉴定采用流式细胞术测定CD14、 CD68， 免疫组化法测定vimentin蛋白。CD14、 CD68均阴性， vimentin蛋白免疫组化染色呈阳性， 证实所分离的细胞为成纤维样滑膜细胞。

　　1.2.2 细胞因子刺激实验 取处于对数生长期的FLS， 经2.5 g/L胰蛋白酶消化后， 反复吹吸成单细胞悬液， 调整细胞密度为2×108 cell/L， 接种于6孔细胞培养板， 37℃贴壁培养24 h后， 弃掉培养液， 用10 mL/L FCSDMEM培养液同步化培养24 h后， 分别加入TWEAK（0、 1、 5、 50、 100 μg/L）各3孔， 其中2孔分别加入TNFα(1 μg/L）或IL1β(0.1 μg/L）， 37℃ 50 mL/L CO2孵箱内持续培养72 h后， 收集细胞培养液和细胞， 并向收集的细胞中加入1 mL TRIzol， 置-20℃备用。

　　1.2.3 MMP3浓度检测 采用双抗夹心ELISA法检测细胞培养液中MMP3的浓度， 按试剂盒提供的说明操作。试剂盒既可测 proMMP3， 又可测活化状态的MMP3。以所测标准品A值作为纵坐标， 标准品浓度为横坐标， 绘制标准曲线。根据细胞培养液样品的A值在标准曲线上查出其浓度。

　　1.2.4 RNA的提取 取加入TRIzol 1 mL冻存的FLS， 经0.2 mL氯仿处理后离心， 上清用异丙醇沉淀， 750 mL/L乙醇洗涤沉淀物， 弃乙醇， 室温干燥后将沉淀溶于适量DEPC水中， 核酸紫外分析仪检测， 计算RNA纯度与浓度， -70℃冰箱保存。

　　1.2.5 反转录聚合酶链反应（RTPCR） cDNA合成采用反转录试剂盒， 总体积为10 μL: RNA模板1 μL， 25 mmol/L MgCl2 2 μL， 10×RT Buffer 1 μL， 10 mmol/L dNTP 1 μL， 反转录酶 0.5 μL， RNase Inhibitor 0.25 μL， Random 9 mers 0.5 μL， RNase Free dh3O 3.75 μL。反应条件: 30℃ 10 min， 42℃ 30 min， 99℃ 5 min， 5℃ 5 min。-20℃ 冰箱冻存以备PCR用。

　　1.2.6 PCR扩增 MMP3引物（上游） 5′ATGAAGAGTCTTCCAATCCTACTGT3′， （下游）5′CATTATATCAGCCTCTCCTTCATAC3′， 扩增产物488 bp; βactin引物（上游） 5′AAATCGTGCGTGACATTAA3′， （下游）5′CTCGTCATACTCCTGCTTG3′， 扩增产物472 bp。反应总体积为50 μL ， 其中5×PCR Buffer 10 μL， 10 mmol/L上游及下游引物1 μL， Taq DNA 聚合酶0.25 μL， cDNA模板10 μL， 加双蒸水至总体积50 μL。退火温度为58℃。

　　1.2.7 PCR反应产物分析 取10 μL扩增产物在含0.5 mmol/L溴化乙啶的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶自动成像分析系统扫描成像， 以电泳条带的密度值作为条带的强度指标， 目的基因与内参照的条带密度比值表示mRNA的相对表达量， 对表达产物进行半定量分析。

　　1.2.8 统计学分析 检测的数据输入SPSS10.0分析软件， 计量资料用x±s表示， 多样本均数比较采用单因素方差分析， 两两比较采用t检验， P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 TWEAK对RA FLS诱导合成MMP3的影响 TWEAK诱导RA FLS合成MMP3的水平如表1所示， 显著高于对照组并呈明显的剂量依赖性， 与空白对照组比具有显著的统计学意义（P&<0.05）; TNFα和IL1β对TWEAK诱导RA FLS合成MMP3具有协同作用， 单纯TWEAK组与协同作用组比较， 协同作用组MMP3的水平明显高于单纯TWEAK组， 具有显著的统计学意义（P&<0.05）; TNFα与IL1β对TWEAK诱导RA FLS合成MMP3的协同作用， 无统计学意义（P&<0.05）。

　　表1 细胞培养液中MMP3的水平（略）

　　Tab 1 The level of MMP3 in cell culture medium

　　aP&<0.05 vs blank group; cP＜0.05 vs TWEAK group in same concentration.

　　2.2 TWEAK对RA FLS诱导MMP3mRNA表达的影响 TWEAK诱导RA FLS的MMP3 mRNA表达如图1所示， TWEAK终浓度为100 μg/L实验组的MMP3 mRNA表达水平高于对照组， 具有显著的统计学意义（P&<0.05）; TNFα和IL1β对TWEAK诱导RA FLS的MMP3 mRNA表达具有协同作用， 单纯TWEAK组与协同作用组比较， 协同作用组MMP3 mRNA表达明显高于单纯TWEAK组， 具有显著的统计学意义（P&<0.05）; TNFα与IL1β对TWEAK诱导RA FLS的MMP3 mRNA表达的协同作用， 无统计学意义。

　　图1 TWEAK诱导RA FLS MMP3mRNA表达（略）

　　Fig 1 TWEAK induce RA FLS MMP3mRNA expression

　　M: DNA marker; 1: FLS+FCSDMEM; 2: FLS+TWEAK(100 μg/L); 3: FLS+TWEAK(100 μg/L)＋TNFα (1 μg/L); 4: FLS+TWEAK(100 μg/L)+IL1β(0.1 μg/L).

　　3 讨论
　　
　　RA是以滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病， 滑膜细胞增生和向周围组织中侵袭、 基质的破坏和降解在RA的发病、 慢性炎症的维持和骨与软骨破坏方面有重要作用［4］。近来研究发现［2］， TWEAK在体外实验中能够诱导FLS产生RANTES、 IP10、 IL8、 PGE2和IL6， 并且在转录因子水平诱导IL6、 IL1、 IL8、 IL15、 IL17表达。另外， 动物实验表明: 应用mAb拮抗TWEAK的作用后， 能够显著减轻CIA鼠关节的炎症反应及滑膜血管增生， 抑制一系列致关节炎症介质的分泌， 包括RANTES、 IP10、 MIP1、 IL6［5］。Perper等［6］研究发现， 单纯阻断TNFα或TWEAK的作用， 只能减轻而不能完全阻断CIA鼠关节炎症的进展， 推测TWEAK与TNFα在CIA鼠关节炎的发生中各自发挥作用并相互协同促进炎症进展。这些研究结果提示， TWEAK可能是另一个与TNFα功能相似的， 在关节炎症和组织损伤过程中处于上游调控的细胞因子。本实验着重研究TWEAK参与关节骨和软骨破坏的作用机制， 进而证实TWEAK在RA发病及进展中的核心地位， 为RA的治疗提供新的方向。以往研究证实［7］， RA过程中关节骨和软骨基质的降解与细胞因子刺激下的软骨和滑膜细胞产生MMP3有关。MMP3对 RA的关节破坏作用至少包括2条途径: 首先为直接降解软骨和骨质。其次 ， MMP3在血管生成方面具有重要的作用， 而后者是 RA的显著特征。血管生成时， 微血管基底膜和间质成分被降解。本研究发现， 外源性TWEAK能够诱导FLS合成MMP3， 上调MMP3 mRNA的表达水平， 并且TWEAK的诱导作用呈明显的剂量依赖性。因而， 我们推测TWEAK可能通过诱导FLS合成MMP3， 直接参与关节骨及软骨的破坏。实验中我们还发现， TNFα和IL1β能够显著增强TWEAK的诱导作用， 提示TWEAK可能与TNFα和IL1β共同作用诱导FLS合成MMP3， 进而参与关节骨及软骨的破坏。TWEAK诱导FLS合成MMPs的具体机制尚不完全清楚， 考虑是与其受体结合， 激活下游的信号转导分子而发挥作用［8］。至于TWEAK诱导FLS合成MMP3的过程中激活了哪些信号转导分子， TNFα和IL1β协同TWEAK诱导FLS合成MMP3的相关机制， 尚需进一步的实验研究。因此， 我们推测TWEAK作为一种新的致关节炎的介质， 能够刺激FLS合成MMP3直接损伤关节骨和软骨， 导致RA的发生和发展， 阻断TWEAK的作用可能成为RA治疗的新策略［9］。

参考文献

　　［1］ Huber LC， Distler O， Tarner I， et al. Synovial fibroblasts; keyplayers in rheumatoid arthritis［J］. Rheumatology (Oxford)， 2006， 45(6): 669-675.
　　
　　［2］ Chicheportiche Y， Chicheportiche R， Sizing I， et al. Proinflammatory activity of TWEAK on human dermal fibroblasts and synoviocytes: blocking and enhancing effects of antiTWEAK monoclonal antibodies［J］. Arthritis Res， 2002， 4(2): 126-133.

　　［3］ Kamijo S， Nakajima A， Kamata K， et al. Involvement of TWEAK/Fn14 interaction in the synovial inflammation of RA［J］. Rheumatology (Oxford)， 2008， 47(4): 442-450.

　　［4］ Rannou F， Franois M， Corvol MT， et al. Cartilage breakdown in rheumatoid arthritis［J］. Joint Bone Spine， 2006， 73(1): 29-36.

　　［5］ Kamata K， Kamijo S， Nakajima A， et al. Involvement of TNFlike weak inducer of apoptosis in the pathogenesis of collageninduced arthritis［J］. J Immunol， 2006， 177(9): 6433-6439.

　　［6］ Perper SJ， Browning B， Burkly LC， et al. TWEAK is a novel arthritogenic mediator［J］. J Immunol， 2006， 177(4): 2610-2620.

　　［7］ Nanki T. Molecular mechanisms of bone destruction in rheumatoid arthritis［J］. Clin Calcium， 2007， 17(4): 510-516.

　　［8］ Han S， Yoon K， Lee K， et al. TNFrelated weak inducer of apoptosis receptor， a TNF receptor superfamily member， activates NFkappa B through TNF receptorassociated factors［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2003， 305(4): 789-796.

　　［9］ Yepes M， Winkles JA. Inhibition of TWEAK activity as a new treatment for inflammatory and degenerative diseases［J］. Drug News Perspect， 2006 ， 19(10): 589-595.