免疫干预实验性自身免疫性重症肌无力小鼠的B细胞活化机制

　　　　　　作者：王蓉， 杨欢， 肖波， 张丽芳

【摘要】 　　目的: 检测脾脏和淋巴结中B细胞活化相关蛋白表达及蛋白磷酸化表达水平的变化， 从B细胞活化的角度探讨Tα146162iMDC干预实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG 的作用机制。方法: 采用树突状细胞(DC)负载Tα146162 干预实验性自身免疫性重症肌无力小鼠（EAMG）的发病， 34只6～8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠， 随机分为模型组（A）、 干预组（B）和对照组（C）。体外培养DC， 然后负载Tα146162进行干预。从初次免疫起至第90天实验终止前， 行EAMG严重性临床评估及发病率的计算。Western blot检测Syk、 Lyn、 Btk和PLCγ2蛋白及蛋白磷酸化表达。结果: 临床评估: A组发病率高于B组（75% vs 25%， P&<0.05）。实验终止时2组临床评分分别为1.69±1.12 vs 0.35±0.67(P&<0.01)。C组小鼠无发病。A组小鼠的脾脏和淋巴结Syk和PLCγ2蛋白表达和磷酸化水平较C组小鼠升高（P&<0.01）， B组较A组下降（P&<0.05）， 但高于C组（P&<0.05）; A组小鼠的脾脏和淋巴结Lyn蛋白表达和磷酸化水平较C组小鼠降低（P&<0.01）， B组较A组升高（P&<0.05）， 但仍低于C组（P&<0.05）; A组小鼠的脾脏和淋巴结Btk蛋白表达较C组小鼠升高（P&<0.01）， B组较A组降低（P&<0.05）， 仍高于C组（P&<0.05）， 但磷酸化水平三组无统计学意义（P&>0.05）。结论: Tα146162iMDC干预， 能显著降低EAMG的发病率， 改善临床症状， 其机制可能与抑制B细胞活化有关。

【关键词】 实验性自身免疫性重症肌无力; Tα146162; 未成熟髓源性树突状细胞; B细胞

　　［Abstract］ AIM: To explore the therapic effect of Tα146162 iMDCs in C57BL/6 mice with experimental autoimmune myasthenia graves(EAMG)， and illustrate whether this therapic effect is related with the change of B cells activation. METHODS: Adult male C57BL/6 mice were randomly pided into EAMG groups(A)， the prevention group(B) and control group(C); Immature bone marrow dendritic cells were cultured and pulsed with Tα146162. Mice of A group and B group were evaluated for clinical score till the day they were put to death. The expression and phosphorylation of Syk， Lyn， Btk and PLCγ2 protein were measured by Western blot. RESULTS: 75% mice of A group and 25% mice of B group were developed the accumulated incidence， the difference was significant (P&<0.05). The average clinical score of A group and B group were 1.69±1.12 vs 0.35±0.67(P&<0.01) at the termination of experiment. The expression and phosphorylation of Syk and PLCγ2 protein in spleen and lymphonode of the mice of A group were higher than those of C group (P&<0.01) and B group (P&<0.05). Compared with C group， those of B group were higher (P&<0.05); The expression and phosphorylation of Lyn protein in spleen and lymphonode of the mice of A (P&<0.01) and B (P&<0.05) groups were lower than those of C group. Compared with A group， those of B group were higher (P&<0.05); The expression of Btk protein in spleen and lymphonode of the mice of A (P&<0.01) and B (P&<0.05) groups were higher than those of C group. And those of B groups were lower than those of A group (P&<0.05). But there were no remarkable differences among the phosphorylation of Btk protein of three groups. CONCLUSION: Tα146162iMDCs can prevent EAMG and probably ameliorate EAMG by the negative regulation on BCR signaling.

　　［Keywords］experimental eutoimmune myasthenia graves; Tα146162; immature bone marrow dendritic cells; B cell

　　实验性自身免疫性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia graves， EAMG）是重症肌无力（myasthenia graves， MG）经典的动物模型。B细胞活化在MG/EAMG发病中是必不可少的。B细胞抗原受体（B cell antigen receptor， BCR）， 简称B细胞受体是B细胞表面标志性分子之一， 参与了抗原的加工处理、 细胞凋亡、 细胞发育以及增生等过程， 对B细胞的产生、 选择和活化具有关键作用［1］。已发现未成熟髓树突状细胞（immature bone marrow dendritic cells， iMDCs）负载Tα146162 （Tα146162iMDC）能诱导TAchR预先致敏的T细胞抗原特异性耐受［2］， 但有关它对B细胞活化的影响研究甚少。
　　
　　我们采用Tα146162iMDC干预EAMG的发病， 测定BCR介导的信号途径中Lyn、 Btk、 PLcγ2、 Syk蛋白表达及蛋白磷酸化表达水平的变化， 从B细胞活化的角度探讨Tα146162iMDC干预EAMG的作用机制， 为临床MG抗原特异性治疗提供理论和实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 从加利福尼亚电鳗的电器官中提取并纯化的TAchR（美国德州大学医学院ChrisTAdos教授惠赠）， -80℃保存备用。耐受肽段Tα146～162（上海GL Biochem公司）， LeuGlyIleTrpThrTyrAspGlyThrLysValSerIleSerProGluSer， 纯度（HPLC）≥95%（52968， GLS）， -80℃保存备用。兔抗小鼠Btk抗体、 兔抗小鼠Syk抗体、 兔抗小鼠Lyn抗体、 兔抗小鼠PLCγ2抗体和HRPpTyr小鼠单克隆抗体（mAb）购自加拿大SantaCruz公司。

　　1.2 实验动物处理与分组 34只近交系无特定病原体（SPF）级6～8周健康雄性C57BL/6J小鼠， 质量20～24 g; 15只SPF级4～6周健康雄性C57BL/6J小鼠， 质量18～22 g， 由中南大学实验动物中心从上海斯莱克斯实验动物有限公司购入。应用SPSS13.0随机数字表， 将34只6～8周C57BL/6J小鼠分为3组: 模型组（A组）: 实验0 d、 30 d、 60 d连续3次以TAChR抗原乳剂200 μL（20 μg TAChR、 100 μL CFA、 100 μL PBS）皮下注射小鼠的双肩及后足垫， 每个部位50 μL免疫动物， 诱导EAMG发作; 干预组（B组）: 实验0 d、 30 d、 60 d连续3次以TAChR抗原乳剂免疫动物， 3 d、 33 d、 63 d分别以负载Tα146～162（50 mg/L）的iMDCs干预; 对照组（C组）: 实验0 d、 30 d、 60 d连续3次予CFA+PBS皮下注射， 3 d、 33 d、 63 d予1 mL PBS皮下注射。按Berman等［3］评分标准做EAMG严重性的临床评估， 评分1分以上者进行发病率的计算。15只4～6周C57BL/6J小鼠用途为取DCs， 不参与分组。

　　1.3 DC的培养 参照胡珏等［2］方法提取骨髓并诱导DC分化。DC表型分析: 收集培养的DC， 用PBS重新将细胞制成悬浮液并调整细胞密度为1×109/L， 台盼蓝染色细胞活力&>95%， 加入试管， 分别加入荧光抗体标记抗体CD11C、 CD40、 CD86和MHCII， 4℃孵育30 min， PBS洗涤2次， 以荧光标记的同型Ig作对照， 流式细胞仪（FACS caliber， BD公司）检测， CellQuest软件分析。

　　1.4 Western blot检测Lyn、 Btk、 PLcγ2、 Syk蛋白表达及蛋白磷酸化表达 小鼠在第90天以断颈法处死， 夹取小鼠腹股沟、 腘窝、 腋下淋巴结及脾脏。胞质裂解液提取蛋白。BCA方法测定蛋白浓度后-70℃保存。50 μg蛋白变性后选用100 g/L SDSPAGE胶分离电泳， 150 mA恒湿法电转移1.5～2 h至硝酸纤维素膜（NC膜）。取出NC膜丽春红染色至看到清楚的条带， 双蒸水洗去丽春红。30 g/L BSA＋50 g/L脱脂奶粉37℃摇床封闭1 h。兔抗小鼠Btk抗体、 兔抗小鼠Syk抗体、 兔抗小鼠Lyn抗体、 兔抗小鼠Btk抗体、 兔抗小鼠PLCγ2抗体和HRPpTyr小鼠mAb， 30 g/L BSA＋50 g/L脱脂奶粉封闭液稀释（1∶500）， 4℃摇床过夜。TBS室温下漂洗3次， 每次10 min。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗（1∶2 000）， 室温下作用1～1.5 h。TBS室温下漂洗3次， 每次10 min。把ECL液均匀加在膜上显色5 min， 吸干ECL液， 暗室中曝光显影、 定影。已加入HRPpTyr小鼠 mAb的NC膜不需再加二抗， 可直接显色。GIS凝胶图像处理系统 V3.74进行胶片分析， 用βactin（1∶2 000）作为内参照蛋白， 实验方法和操作步骤均与目的蛋白相同。目的蛋白光密度与βactin光密度比值即为目的蛋白的相对值。

　　1.5 统计学分析 结果用x±s表示， SPSS13.0 软件包分析。成组设计的多样本间均数的比较用方差分析， 两样本均数的比较用t检验， 多样本均数间每两个样本的比较用q检验。半定量评分两样本间比较用MannWhitney U检验。

　　2 结果

　　2.1 DC形态学特征及表型 培养24 h后， 倒置相差显微镜下可见贴壁的单核细胞聚集成团并均匀分布， 细胞呈小圆形。随后细胞数目逐渐增多。培养第3天可见较多细胞疏松的黏附于板壁呈簇状生长， 细胞形态小而圆， 此后细胞体积逐渐增大。第6天于相差显微镜下可见细胞呈不规则圆形贴壁生长， 表面有少量的毛刺形成。流式细胞仪表型分析示CD11C+、 CD40low、 CD86low和MHCIIlow， 证实所培养的细胞是iMDC。

　　2.2 实验小鼠的行为及形态学 EAMG小鼠发病后出现不同程度的肌无力， 表现为活动减少、 摄食减少、 撕咬无力、 消瘦、 弓背低头垂尾姿势、 甚至全身衰竭等。其肌无力症状经新斯的明实验可暂时性改善。

　　2.3 实验小鼠的发病率及临床评分 模型组和干预组小鼠在第1次免疫后30 d均未发病。第39天， 模型组有2/12 (16.7%)的小鼠发病， 干预组至第57天才有1/12(8.3%)小鼠发病， 较模型组发病延迟。实验终止时， 模型组累计有9/12 (75%)的小鼠发病， 干预组累计3/12 (25%)的小鼠发病， 两组发病率差异具有统计学意义(P&<0.05)。在人为处死之前， 模型组小鼠因疾病严重而自然死亡1只， 干预组未出现自然死亡。从第66天起两组平均临床评分有统计学意义， 分别为（0.75±0.87） vs （0.17±0.39）（P&<0.05）， 实验终止时两组分别为（1.67±1.15） vs （0.33±0.65）（P&<0.01）。

　　2.4 各组小鼠脾脏和淋巴结Syk蛋白及磷酸化表达 模型组小鼠脾脏和淋巴结Syk蛋白表达水平较对照组小鼠明显升高（0.808±0.100 vs 0.374±0.189， 0.746±0.101 vs 0.340±0.092， P&<0.01）; 干预组小鼠脾脏和淋巴结的Syk蛋白表达水平较模型组下降（0.627±0.142 vs 0.808±0.100， 0.571±0.086 vs 0.746±0.101， P&<0.05）， 高于对照组。模型组和干预组小鼠脾脏（0. 536±0.067 vs 0.181±0.067， 0.415±0.113 vs 0.181±0.067， P&<0.01）和淋巴结Syk蛋白磷酸化水平（0.476±0.081 vs 0.165±0.049， 0.349±0.096 vs 0.165±0.049， P&<0.01）均高于对照组; 干预组小鼠脾脏和淋巴结的Syk蛋白磷酸化表达水平较模型组下降（P&<0.05， 图1）。

　　图1 各组小鼠脾脏和淋巴结Syk蛋白和磷酸化表达（略）

　　Fig 1 The expression and phosphorylation of Syk protein in spleen and lymphonode of three groups

　　1-3: Spleen. 1: EAMG group; 2: Treatment group; 3: Control group; 4-6: Lymphonode. 4: EAMG group; 5: Treatment group; 6: Control group.

　　2.5 各组小鼠脾脏和淋巴结Lyn蛋白及磷酸化表达水平 模型组小鼠脾脏和淋巴结Lyn蛋白表达水平较对照组均明显降低（0.313±0.110 vs 0.701±0.193， 0.264±0.101 vs 0.672±0.109， P&<0.01）; 干预组小鼠脾脏和淋巴结的Lyn蛋白表达水平较模型组升高（0.496±0.087 vs 0.313±0.110， 0.448±0.076 vs 0.264±0.101， P&<0.05）低于对照组。模型组和干预组小鼠脾脏（0.246±0.099 vs 0.586±0.136， 0.390±0.115 vs 0.586±0.136， P&<0.01）和淋巴结Lyn蛋白磷酸化水平（0.218±0.087 vs 0.554±0.092， 0.369±0.067 vs 0.554±0.092， P&<0.05）均低于对照组; 干预组较模型组升高（P&<0.05）， 但低于对照组（P&<0.05， 图2）。

　　图2 各组小鼠脾脏和淋巴结Lyn蛋白和磷酸化表达（略）

　　Fig 2 The expression and phosphorylation of Lyn protein in spleen and lymphonode of three groups

　　1-3: Spleen. 1: EAMG group; 2: Treatment group; 3: Control group; 4-6: Lymphonode. 4: EAMG group; 5: Treatment group; 6:　　Control group.

　　2.6 各组小鼠脾脏和淋巴结Btk蛋白及磷酸化表达水平 模型组小鼠的脾脏和淋巴结Btk蛋白表达水平较对照组小鼠（0.741±0.120 vs 0.378±0.151， 0.665±0.131 vs 0.327±0.119， P&<0.01）均升高， 干预组较模型组降低（0.565±0.108 vs 0.741±0.120， 0.494±0.106 vs 0.665±0.131， P&<0.05）， 高于对照组。三组小鼠脾脏和淋巴结Btk蛋白磷酸化水平无统计学意义（P&>0.05， 图3）。

　　2.7 各组小鼠脾脏和淋巴结PLCγ2蛋白及磷酸化表达水平 模型组小鼠的脾脏和淋巴结PLCγ2蛋白表达水平较对照组小鼠明显升高（0.693±0.148 vs 0.265±0.151， 0.650±0.117 vs 0. 206±0.118， P&<0.01）， 干预组较模型组下降（0.498±0.108 vs 0.693±0.148， 0.454±0.096 vs 0.650±0.117， P&<0.05）， 高于对照组。模型组和干预组小鼠脾脏（0.577±0.090 vs 0.228±0.164， 0.437±0.113 vs 0.228±0.164， P&<0.01）和淋巴结PLCγ2蛋白磷酸化水平（0.545±0.107 vs 0.204±0.129， 0.394±0.116 vs 0.204±0.129， P&<0.01）均高于对照组， 干预组较模型组下降（P&<0.05）， 高于对照组（P&<0.05， 图4）。

　　图3 各组小鼠脾脏和淋巴结Btk蛋白和磷酸化表达（略）

　　Fig 3 The expression and phosphorylation of Btk protein in spleen and lymphonode of three groups

　　1-3: Spleen. 1: EAMG group; 2: Treatment group; 3: Control group; 4-6: Lymphonode. 4: EAMG group; 5: Treatment group; 6: Control group.

　　图4 各组小鼠脾脏和淋巴结PLCγ2蛋白和磷酸化表达（略）

　　Fig 4 The expression and phosphorylation of PLCγ2 protein in spleen and lymphonode of three groups

　　1-3: Spleen. 1: EAMG group; 2: Treatment group; 3: Control group; 4-6: Lymphonode. 4: EAMG group; 5: Treatment group; 6: Control group.

　　3 讨论
　　
　　EAMG动物模型是研究MG的常用模型， 我们采用Torpedo californica AChR（TAChR）与CFA的混合乳剂皮下注射C57BL/6J小鼠成功诱导模型。TAChR α亚单位上的优势区域146～162肽段 （Tα146～162）在免疫应答中具有重要作用。DCs是一类重要的抗原提呈细胞， 其中未成熟的树突状细胞（iDC）可诱导外周耐受。前期实验发现Tα146162iMDC可有效阻抑 EAMG 发病， 并能诱导TAChR预先致敏的T细胞抗原特异性耐受［2］， 但其与B细胞活化关系的研究很少。
　　
　　BCR是 B 细胞表面标志性分子之一， 在B细胞的产生、 选择和活化过程中发挥关键作用［4］。BCR 与抗原发生交联反应后蛋白酪氨酸激酶（PTK）活化， 是抗原受体介导的 B 细胞活化的主要生化过程， 其中最重要的是具有 PTK 活性的 Src 家族激酶， 包括 Src、 Lyn 等， 抗原与 BCR 交联反应后迅速激活 Src 家族 PTK， 而后募集和激活 Syk 及 Bruton’s 酪氨酸激酶（Btk）， 转导多个下游途径， 包括磷脂酶C（PLC）γ2、 Ras 和 PI3K 等通路。Lyn 蛋白为 BCR 信号途径重要的负性调控因子， 其表达水平的变化可影响 BCR 信号和 B 细胞的活性［5］。研究发现， EAMG 小鼠 Lyn 蛋白表达水平及磷酸化水平较正常组明显下降， 提示 Lyn 对 BCR 信号途径的负性调控作用减弱， 免疫干预后小鼠 Lyn 表达水平高于模型组， 表明 Tα146162iMDC 可能有增加 Lyn 表达和磷酸化的作用。Syk， 一种非 Src PTK， 对细胞表面 IgM 介导的信号途径具有重要作用， 不仅是 Src 家族激酶下调的靶蛋白， 还可作为未成熟 B 细胞中 Lyn 的上游途径因子， 缺乏 Syk B 细胞对 BCR 刺激可失反应［6］。研究中发现， 模型组小鼠 Syk 蛋白表达水平及磷酸化水平较对照组明显升高， 提示可能是由于 Lyn 对 BCR 信号途径的负性调控作用减弱， Syk 正性调控作用相对增强， 而 Tα146162 iMDC 可能通过增加 Lyn 表达以及磷酸化， 抑制 Syk 对 BCR 途径的正性调控。Btk 是 BCR 活化信号中调节细胞存活和细胞周期循环的关键分子［7］。研究发现虽然 EAMG 小鼠 Btk 蛋白表达高于干预组， 但磷酸化水平三组并无明显差异， 表明 EAMG 小鼠 Btk 蛋白磷酸化未受影响， 推测 Tα146162 iMDC 并不能影响 Btk 对 BCR 信号途径的正性调控作用。PLCγ2 是 BCR 信号途径的关键性下游效应子之一， 可分解 PIP2， 释放 IP3 和 DAG， 引起细胞内 Ca2+池释放， 对 NFκB 的活化也非常重要［8］。BCR 交联后激活邻近的 Syk 和 Btk， 促使 PLCγ2 活化和磷酸化。本实验模型组BCR 信号途径正性调控因子 PLCγ2 蛋白和磷酸化水平升高， 表明 BCR 受 AchR 刺激后， PLCγ2 激活发生磷酸化引起 BCR 下游信号途径转导， 使 B 细胞活化， 而 Tα146162iMDC 可降低小鼠 PLCγ2 蛋白和磷酸化水平， 提示PLCγ2 磷酸化可能受到了抑制。
　　
　　由此可推测， 通过加强对 BCR 信号途径的负性调控， 抑制自身反应性 B 细胞的活化， 诱导 B 细胞耐受是 Tα146162iMDC 干预 EAMG 发病的另一种可能机制。

参考文献

　　［1］ Tajiri K， Kishi H， Tokimitsu Y， et al. Cellmicroarray analysis of antigenspecific Bcells: single cell analysis of antigen receptor expression and specificity［J］. Cytometry A， 2007， 71(11): 961-967.

　　［2］ 胡 珏， 杨 欢， 肖 波， 等. 树突状细胞负载Tα146162预防实验性自身免疫性重症肌无力的实验研究［J］. 中华神经科杂志， 2006， 39(4): 224-228.

　　［3］ Berman PW， Patrick J. Experimental myasthenia gravis: a murine system［J］. J Exp Med， 1980， 151(1): 204-223.

　　［4］ Schram BR， Tze LE， Ramsey LB， et al. B cell receptor basal signaling regulates antigeninduced Ig light chain rearrangements［J］. J Immunol， 2008， 180(7): 4728-4741.

　　［5］ FloresBorja F， Kabouridis PS， Jury EC， et al. Decreased Lyn expression and translocation to lipid raft signaling domains in B lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus［J］. Arthritis Rheum， 2005， 52(12): 3955-3965.

　　［6］ Oh H， Ozkirimli E， Shah K， et al. Generation of an analogsensitive Syk tyrosine kinase for the study of signaling dynamics from the B cell antigen receptor［J］. J Biol Chem， 2007， 282(46): 33760-33768.

　　［7］ Wang LD， Lopes J， Cooper AB， et al. Selection of B lymphocytes in the periphery is determined by the functional capacity of the B cell antigen receptor［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101(4): 1027-1032.

　　［8］ BourginHierle C， GobertGosse S， Thérier J， et al. Srcfamily kinases play an essential role in differentiation signaling downstream of macrophage colonystimulating factor receptors mediating persistent phosphorylation of phospholipase Cgamma2 and MAP kinases ERK1 and ERK2［J］. Leukemia， 2008， 22(1): 161-169.