NFκB介导促红细胞生成素神经细胞保护作用的研究

　　　　 作者：董文斌， 侯红梅， 王琼， 陈枫， 航永伦

【摘要】 　　目的: 观察促红细胞生成素(EPO)对谷氨酸（Glu）诱导的大脑皮质神经元损伤的保护作用和核因子κB(NFκB)介导的细胞内信号转导机制。方法: 采用1日龄Wistar大鼠皮层神经细胞体外原代培养技术， 建立Glu兴奋性毒性神经细胞损伤模型。实验分为正常对照组、 Glu组、 EPO组和吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC， NFκB活化阻断剂）组。倒置显微镜下观察细胞的形态学改变; MTT法测定细胞存活率; 流式细胞术测定细胞凋亡率评价细胞损伤程度。结果: Glu处理后神经细胞形态明显受损， EPO组神经细胞形态趋于正常， PDTC组细胞形态与Glu组相似; 与正常对照组相比， Glu组神经细胞存活率明显下降、 凋亡率明显升高， 差异均有统计学意义（P&<0.01）; 而与Glu组相比， EPO组神经细胞存活率明显增高下降、 凋亡率明显下降， 差异均有统计学意义（P&<0.01）。与EPO组相比， PDTC组细胞存活率明显下降、 凋亡率明显升高， 差异均有统计学意义（P&<0.01）， 这些变化与Glu组相似。结论: EPO对Glu诱导的大脑皮质神经元损伤的具有保护作用， 其胞内信号转导机制涉及到NFκB的活化。

【关键词】 促红细胞生成素 谷氨酸 神经元 核因子 κB 信号传导

　　新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxicischemicencephalopathy， HIE）是导致儿童伤残的重要疾病之一。谷氨酸(glutamate， Glu)的大量释放是其神经细胞损伤的主要原因［1］。研究显示: 促红细胞生成素(erythropoitin， EPO)对Glu诱导的神经细胞损伤具保护作用［2， 3］， 其胞内信号机制尚不清楚，国外研究认为核因子κB(NFκB)活化介导其信号传导过程［3， 4］。本研究在前期工作的基础上［1， 3］， 进一步从NFκB活化途径探讨EPO对Glu诱导的神经毒性的保护机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 Wistar新生大鼠(1日龄)由泸州医学院标准动物科提供; Neurobasal Medium（NM）， B27系Gibco公司产品; Glu， RPMI1640， 四甲基偶氮唑盐（MTT）均购于Sigma公司; 小牛血清系成都美特科技有限公司产品; EPO购于成都地奥制药公司; 四氢吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）为Sigma公司产品; Annexin VFITC凋亡检测试剂盒购于达克为生物技术有限公司; 流式细胞仪(Epics型)为Coulter Company产品; 倒置显微镜(XSJD型)为Olympus产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大脑皮层神经细胞原代培养 取1日龄的新生大鼠， 碘酒和750 mL/L的乙醇消毒皮肤后取双侧大脑皮质， 剔除软脑膜和血管。Hank’s液冲洗2遍。终浓度1.25 g/L胰蛋白酶常温下消化5 min， 1000 r/min离心10 min， 弃上清， 用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640悬浮混匀， 制成1×106/L密度的细胞悬液。接种于96孔培养板（100 μL/孔）， 24孔培养板（1 mL/孔）， 35 mm培养皿中（2 mL/皿）。置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中， 24 h后换无血清培养液， 成分为NM 49%（V/V）、 RPMI164049%（V/V）、 2% B27（V/V）。每3 d半量换液1次， 培养8 d。

　　1.2.2 实验分组 上述培养8 d的皮层神经细胞作如下分组: （1）正常对照组: 不加Glu， 余处理相同; （2）Glu组: 加入含Glu的无血清培养液（Glu终浓度200 μmoL/L）， 作用30 min， Hank’s冲洗2遍后， 换新鲜培养液， 继续培养24 h; （3）EPO处理组: 加入Glu前24 h加入最佳干预终浓度为30 pmol/L 的EPO; （4）PDTC组: 最佳干预终浓度EPO作用24 h后加入含0.1 mmol/L PDTC的无血清培养基孵育30 min， 余处理同EPO组。

　　1.2.3 实验指标的检测 在倒置显微镜下观察神经细胞的形态学变化。MTT法测定神经细胞存活率: Glu作用30 min后换新鲜培养液继续培养24 h， 取96孔培养板， 每孔加入MTT溶液（5 μg/L） 20 μL， 37℃继续培养4 h， 终止培养， 小心吸弃上清， 每孔加入150 μL二甲亚枫（DMSO）， 震荡15 min使沉淀充分溶解。在微孔酶标仪在490 nm处测定其光吸收值。存活率用百分率表示， 对照组为100%。流式细胞术检测细胞凋亡率: Glu作用30 min后换新鲜培养液， 继续培养24 h， 将每皿的细胞消化、 离心、 收集于离心管中， 制成单细胞悬液， 按凋亡试剂盒要求， 加入500 μL Buffer液， 振荡摇匀。再加入5 μL AnnexinⅤ和5 μL PI液， 冰上避光反应5 min， 在流式细胞仪上检测神经细胞凋亡率。

　　1.2.4 统计学处理 细胞存活率、 细胞凋亡率均用%表示， 所有结果均以x±s表示， 采用单因素方差分析法， 组间两两比较采用LSD检验。均使用SPSS11.0软件进行数据分析。

　　2 结果

　　2.1 细胞形态学观察 正常对照组皮层神经细胞形态典型， 神经原突起明显并交织成网， 胞体增大。Glu处理后神经细胞明显损伤， 部分细胞胞体缩小、 变圆、 突起减少或消失、 折光性减弱， 部分细胞甚至溶解， 仍有少数细胞保持神经细胞形态。EPO处理组神经细胞形态趋于正常， 与Glu组相比细胞损伤明显减轻。PDTC组细胞形态与Glu组相似(图1)。

　　图1 EPO对Glu诱导神经细胞损伤的保护作用 （略）

　　Fig 1 Protective effect of EPO on Glutinduced cortical neurons against damage (×200)

　　A: Control group; B: Glu group; C: EPO group; D: PDTC group(Protective effect of EPO on Gluinduced cortical neurons against damage).

　　2.2 细胞活性测定结果 与正常组相比， Glu组神经细胞存活率明显下降， 差异有统计学意义（P&<0.01）。与Glu组相比， EPO组神经细胞的存活率均明显升高， 差异有统计学意义（P&<0.01）。PDTC组与EPO组相比， 神经细胞存活率明显下降， 差异均有统计学意义（P&<0.01）， 与Glu组结果相似（表1）。

　　2.3 各组皮层神经细胞凋亡的变化 与正常组相比， Glu组神经细胞凋亡率明显升高， 差异有统计学意义（P&<0.01）。与Glu组相比， EPO组神经细胞的凋亡率均明显降低， 差异有统计学意义（P&<0.01）。PDTC组与 EPO组相比， 神经细胞凋亡率明显升高， 差异均有统计学意义（P&<0.01）， 与Glu组结果相似（图2， 表1）。

　　图2 各组皮层神经细胞凋亡率的变化 （略）

　　Fig 2 Apoptosis of cortical neurons in different groups

　　a: Control group; b: Glu group; c: EPO group; d: PDTC group.

　　表1 各组皮层神经细胞损伤指标的变化（略）

　　Tab 1 The changes in injury parameters of neurons in in different groups

　　bP&<0.01 vs control group; dP&<0.01 vs Glu group; fP&<0.01 vs EPO group.

　　3 讨论
　　
　　从机体内源性保护机制出发， 探讨缺氧缺血性损伤的保护可能成为缺氧缺血性脑病治疗的一个新的切入点。EPO是一种多功能的细胞因子。对各种脑损伤起保护作用。本研究在建立Glu诱导神经细胞凋亡模型的基础上进一步证实EPO的神经保护及抗凋亡作用。
　　
　　EPO通过细胞内何种信号途径发挥其抗凋亡作用， 目前尚不清楚。研究证明［3， 5， 6］EPO可通过EPOEPORJAKPI3KPKB/AKTBad这条途径起到抗凋亡的作用。但这条信号转导途径并不是惟一的一条， 近年来发现， NFκB可以调控凋亡的相关基因， 如可以直接上调凋亡抑制因子（cIAP、 cIAP2和IAXP）、 肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF1和TRAF2）、 锌指蛋白A20、 超氧化锰歧化物、 Bcl2同系物AI/Bfl1和IEXIL等抗凋亡基因的表达，起到抑制细胞凋亡的作用。EPO抗神经细胞凋亡的过程中， EPO与其受体结合后， 是否激活NFκB的抗凋亡途径［4］， 将是一个十分感兴趣的问题。
　　
　　本实验在EPO预处理24 h后， 未暴露于Glu之前加入PDTC抑制NFκB的活性， 观察EPO的抗凋亡作用是否受到影响。结果表明， PDTC能明显抑制EPO的抗凋亡作用。提示: EPO拮抗Glu诱导的神经细胞凋亡的过程激活了NFκB。这与Digecaylioglu等［4］的研究相一致。其信号转导途径可能为: EPO抗神经细胞凋亡的过程中， EPO与其受体结合后， 导致JAK激活， 被JAK激活的NFκB从胞质转移到胞核导致NFκB依赖性神经保护基因的转录， 包括某些凋亡抑制因子， 如XIAP和CLAP2等。这些凋亡抑制因子通过抑制caspases的激活而抑制了细胞凋亡［7-9］。但是， 其具体的机制尚需进一步研究。

参考文献

　　［1］ 侯红梅， 董文斌， 王 琼， 等. 谷氨酸诱导新生大鼠皮层神经元毒性损伤的作用［J］. 实用儿科临床杂志， 2005， 20（3）: 255-256.

　　［2］ 侯红梅， 董文斌. 促红细胞生成素与脑保护［J］. 国外医学·神经病学神经外科学分册， 2004， 31: 494-497.

　　［3］ 侯红梅， 董文斌， 王 琼， 等. 促红细胞生成素对谷氨酸致培养皮层神经细胞损伤的保护作用［J］. 中华围产医学杂志， 2005， 9（5）: 348-349.

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　　［5］ Siren AL， Knerlich F， Poser W， et al. Eeythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemicl hypoxic brain［J］. Acta Neuropathol(Berl)， 2001， 101(3): 271-276.

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　　［8］ Li F， Chong ZZ， Maiese K. Microglial integrity is maintained by erythropoietin through integration of Akt and its substrates of glycogen synthase kinase3beta， betacatenin， and nuclear factorkappaB［J］. Curr Neurovasc Res， 2006， 3(3): 187-201.

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