脱氢表雄酮对实验性自身免疫性神经炎大鼠细胞免疫的影响

【摘要】 目的: 探讨脱氢表雄酮（DHEA）对实验性自身免疫性神经炎（EAN）大鼠细胞免疫反应的影响。方法:　21只Lewis大鼠随机分为DHEA 0.5 mg治疗组、 2 mg治疗组和对照组， 治疗组于注射牛周围神经髓磷脂（BPM）抗原乳剂后第5天开始每日皮下注射DHEA， 对照组皮下注射相同体积的DHEA溶媒。疾病高峰期检查坐骨神经IFNγ、 TNFα阳性反应细胞， 检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞增殖反应， 检测培养上清TNFα、 IFNγ、 IL10含量。结果: 两种剂量DHEA治疗组均能减少坐骨神经IFNγ、 TNFα阳性反应细胞数目(P&<0.05)， 抑制BPM刺激T淋巴细胞增殖(P&<0.05)， 降低培养上清中IFNγ、 TNFα水平(P&<0.05)。各组间 IL10水平差异无统计学意义（P&>0.05）。结论: DHEA可抑制EAN大鼠自身反应性T淋巴细胞增殖和促炎性细胞因子过度表达， 抑制细胞免疫反应。

【关键词】 脱氢表雄酮 神经炎 实验性自身免疫性 细胞免疫

　　脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone， DHEA）是3种肾上腺皮质类固醇之一， 是雌激素和雄激素的前体物质， 也是目前尚不明确的多种免疫调节性类固醇的前体物质。体内、 外研究证实DHEA及其代谢产物具有抗炎、 抗增殖和免疫调节活性， 对人和动物的免疫系统可产生有益的作用［1］。DHEA能改善病毒、 细菌或其他感染实验动物的存活率［2］; 尘螨诱导的变应性气道疾病小鼠服用DHEA， 可降低支气管灌洗液中嗜酸细胞数目， 降低IL4、 IL5、 IFNγ和IgE水平［3］; 超生理浓度的DHEA可抑制T细胞受体介导的体外T淋巴细胞增殖， 使KLH致敏脾脏细胞IL4生成增加、 IFNγ水平下降［4］; 系统性红斑狼疮患者服用DHEA治疗， 表现出明显的病情改善， 对糖皮质激素治疗需求量减少［5］。上述研究提示DHEA影响细胞和体液免疫应答。实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis， EAN）是CD4+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病， 是公认的研究格林巴利综合征（GBS）的经典动物模型， 目前国内外尚未见有DHEA影响EAN免疫反应的报道。基于以往体内外研究证实的DHEA对免疫系统的作用， 我们应用DHEA干预发病初期EAN大鼠， 观察对细胞免疫反应的影响， 以探讨治疗GBS的新方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 DHEA、 二甲基亚砜、 弗氏不完全佐剂均购自SigmaAldrich公司; H37Ra株热灭活结核杆菌、 植物血凝素（PHA）购自Difco公司; 免疫组化用一抗购自R＆D公司， 二抗购自Invitrogen公司; Ficocl淋巴细胞分离液、 RPMI1640培养液、 胎牛血清均购自Gibco公司; 3H甲基胸腺嘧啶核苷购自中国原子能研究所; 酶联免疫分析试剂盒购自Bender MedSystem， Inc公司。超速离心法自牛脊神经根提取周围神经髓磷脂（bovine peripheral myelin， BPM）; Lewis大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组 6～8周龄雌性Lewis大鼠21只， 质量150～170 g， 随机分为DHEA 0.5 mg/剂治疗组（T1）、 2 mg/剂治疗组(T2)和对照组(C)， 每组7只。大鼠经适应性饲养1周（SPF级）， 氯胺酮（10 mg/kg）麻醉， 将BPM、 H37Ra株热灭活结核杆菌和生理盐水制成混悬液， 与等量弗氏不完全佐剂充分乳化， 100 μL抗原乳剂（含BPM 5 mg、 结核杆菌 1 mg）注入双侧后肢足垫皮下。自免疫后第5天开始皮下注射DHEA， 体积50 μL， 每日1次。对照组每日皮下注射相同体积的DHEA溶媒二甲基亚砜。

　　1.2.2 免疫组化检查 于免疫后16 d（EAN高峰期）处死大鼠， 取坐骨神经近脊髓段， 40 g/L多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 纵行切片（5～6 μm， 每根神经2张连续切片）， 常规脱蜡致水， 30 mL/L过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性， 枸橼酸（pH6.0）抗原修复， 100　　mL/L牛血清白蛋白封闭， 滴加一抗室温下60 min。一抗为羊抗大鼠IFNγ、 TNFα多克隆抗体， 二抗为辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG， DAB显色， 苏木苏复染， 脱水， 透明， 封固。应用计算机图像分析系统40倍物镜下采集图像， 每张切片随机取5个视野， 观察大鼠坐骨神经中细胞阳性反应， 细胞核周围呈棕黄色的浸润炎性细胞、 施万细胞、 血管内皮细胞计数为阳性反应细胞， 取其平均值， 结果以细胞数/mm2组织表示。

　　1.2.3 体外淋巴细胞增殖试验 取免疫后16 d EAN大鼠腹股沟、 腘窝淋巴结和脾脏， 过钢网研磨制备单个细胞悬液， Ficocl淋巴细胞分离液2 000 r/min， 离心20 min， 收获单个核细胞， RPMI1640培养液冲洗3次， 悬浮于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 调整细胞密度为2×109/L ， 接种到96孔培养板， 200 μL/孔， 分别加入10 μL BPM (终浓度 20 mg/L)、 PHA（终浓度 10 mg /L）或PBS， 培养48 h， 再加入3H甲基胸腺嘧啶核苷1 μCi/孔， 18 h后将细胞收集于玻璃纤维滤器上， β液体闪烁仪检测胸腺嘧啶核苷结合量， 结果以每分钟放射性荧光闪烁计数值（cpm）表示。

　　1.2.4 淋巴细胞培养上清液细胞因子检测 来自引流淋巴结和脾脏的单个核细胞悬液（2×109/L）， 加入BPM (终浓度20 mg/L)培养48 h， 收获上清液。应用酶联免疫分析试剂盒检测TNFα、 IFNγ、 IL10， 操作按说明书步骤进行。标准品和样本均设双复孔， 结果以ng/L表示。

　　1.2.5 统计学分析 应用 SPSS13.0软件对资料进行统计分析， 数据以x±s表示。应用单因素方差分析或秩和检验（KruskalWallis检验法）进行组间比较， 组间差异有统计学意义则用SNK法或 Bonferroni法进行组间两两比较， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 DHEA减少外周神经促炎细胞因子产生 应用免疫组化技术检测EAN高峰期大鼠坐骨神经中IFNγ、 TNFα表达， 结果显示 DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组IFNγ、 TNFα阳性反应细胞数均较对照组明显减少(P&<0.05 )， DHEA 2 mg 治疗组与0.5 mg治疗组比较IFNγ、 TNFα阳性反应细胞数未见明显差异（表1， 图1、 2）。

　　表1 坐骨神经细胞因子阳性细胞数（个/mm2组织）（略）

　　Tab 1 Numbers of cytokineexpressing cells per mm2 sciatic nerve sections

　　aP&<0.05 vs control group.

　　图1 坐骨神经IFNγ表达（略）

　　Fig 1 IFNγexpressing cells in sciatic nerve sections

　　A: Control group; B: DHEA 0.5 mg/day; C: DHEA 2 mg/day.

　　图2 坐骨神经TNFα表达（略）

　　Fig 2 TNFαexpressing cells in sciatic nerve sections

　　A: Control group; B: DHEA 0.5 mg/day; C: DHEA 2 mg/day.

　　2.2 DHEA抑制淋巴细胞增殖反应 于EAN高峰期检测大鼠引流淋巴结和脾脏单个核细胞增殖。与对照组比较， DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组均能明显抑制BPM和PHA诱导的单个核细胞增殖(P&<0.05 ); PBS(无抗原刺激)组单个核细胞培养显示DHEA 2 mg治疗组对单个核细胞增殖有明显抑制作用(P&<0.05)， 0.5 mg治疗组与对照组比较无统计学意义（表2）。

　　表2 淋巴细胞体外增殖反应（略）

　　Tab 2 T cell proliferation in vitro (cpm)

　　aP&<0.05 vs control group.

　　2.3 DHEA影响单个核细胞培养上清中细胞因子水平 应用ELISA检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞培养上清中IFNγ、 TNFα、 IL10水平。结果显示， 与对照组比较， DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组均能减少IFNγ和TNFα生成(P&<0.05)， DHEA 2 mg治疗组IFNγ和TNFα水平较0.5 mg 治疗组降低(P&<0.05); 各组间 IL10水平未显示明显的差异（表3）。

　　表3 BPM刺激单个核细胞培养上清细胞因子水平比较（略）

　　Tab 3 Levels of cytokine production by BPMrestimulated spleen cell supernatants

　　aP&<0.05vs control group.

　　3 讨论
　　
　　DHEA是人体内含量最丰富的类固醇， 已有许多研究证实DHEA或其代谢产物可调节Th1/Th3细胞免疫失衡， 可能对自身免疫性疾病有治疗作用［6， 7］。EAN是由外周神经髓磷脂或其蛋白质成分主动免疫或通过过继转移外周神经抗原特异性T细胞在易感啮齿类动物诱导的， 是CD4+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病。我们应用DHEA干预发病初期EAN（免疫后炎症阶段）， 结果显示， DHEA 0.5 mg/剂和2 mg/剂两种剂量均能抑制BPM诱导的单个核细胞增殖， 减少病灶局部及BPM刺激后单个核细胞培养上清IFNγ、 TNFα产生， 提示DHEA可抑制细胞免疫反应， 抑制Th1细胞功能。Du等［6］应用DHEA治疗SJL/J 小鼠过继转移性EAE， 可阻止病情进展， 降低脊髓促炎性细胞因子IFNγ、 IL12p40、 TNFα、 iNOSmRNA表达。Offner等［8］应用人工合成的DHEA衍生物HE2200和DHEA代谢产物HE2500预防性治疗SJL小鼠EAE， 两者均可减轻疾病严重程度， 降低血浆中PLP特异性抗体水平， 抑制PLP诱导的淋巴细胞增殖， 降低脊髓中TNFα、 TNFβ、 IFNγ、 MIP1α、 MCP1 mRNA表达。上述研究与我们的结论一致。
　　
　　外周神经内膜下T淋巴细胞、 巨噬细胞浸润及多灶性、 节段性髓鞘脱失是EAN的主要病理改变， 促炎细胞因子（IFNγ、 TNFα、 IL12、 NO等）在发病机制中起重要作用。外周神经内膜下浸润的T淋巴细胞释放IFNγ激活巨噬细胞， 后者通过吞噬作用和释放炎性细胞因子（如TNFα）， 直接损伤神经髓鞘。有证据表明， IFNγ在血清、 外周淋巴组织和周围神经中的水平与EAN临床症状相平行， IFNγ缺失小鼠抵抗EAN的发生［9］。TNFα被认为在免疫介导的髓鞘脱失中起直接作用， 向大鼠坐骨神经中注射TNFα， 导致神经内膜血管壁淋巴细胞聚积， 髓鞘脱失， 轴索变性［10］。提示IFNγ和TNFα在EAN发病中的关键作用。本研究显示， DHEA可降低全身和病灶局部IFNγ、 TNFα水平， 对IL10产生无影响。推测DHEA对EAN的治疗作用主要是下调Th1反应， 抑制促炎性细胞因子过度分泌， 对Th3细胞因子水平无影响。
　　
　　我们的实验结果显示， 与0.5 mg/剂治疗组比较， 2 mg/剂治疗组能明显减少单个核细胞培养上清IFNγ、 TNFα产生， 提示DHEA对免疫功能的影响存在剂量相关性。
　　
　　细胞因子生成过多是以Th1/Th3为基础的免疫失调的中心环节， 如何纠正机体的免疫失调， 是目前治疗自身免疫性疾病所面临的关键问题。虽然DHEA及其代谢产物在调节Th1/Th3细胞功能中的确切作用尚存在争议［11］， 但是上述实验结果表明， 该类分子是促炎性细胞因子过度表达的抑制剂， 可能对T淋巴细胞、 巨噬细胞等多种免疫细胞产生作用， 有希望成为治疗自身免疫性疾病的一种新手段。

参考文献

　　［1］ von Mühlen D， Laughlin GA， KritzSilverstein D， et al. The Dehydroepiandrosterone And WellNess (DAWN) study: research design and methods［J］. Contemp Clin Trials， 2007， 28(2): 153-168.

　　［2］ Oberbeck R， Dahlweid M， Koch R， et al. Dehydroepiandrosterone decreases mortality rate and improves cellular immune function during polymicrobial sepsis［J］. Crit Care Med， 2001， 29(2): 380-384.

　　［3］ Yu CK， Yang BC， Lei HY， et al. Attenuation of house dust mite Dermatophagoides farinaeinduced airway allergic responses in mice by dehydroepiandrosterone is correlated with downregulation of Th3 response［J］. Clin Exp Allergy， 1999， 29(3): 414-422.

　　［4］ Du C， Guan Q， Khalil MW， et al. Stimulation of Th3 response by high doses of dehydroepiandrosterone in KLHprimed splenocytes［J］. Exp Biol Med (Maywood)， 2001， 226(11): 1051-1060.

　　［5］ van Vollenhoven RF. Dehydroepiandrosterone for the treatment of systemic lupus erythematosus［J］. Expert Opin Pharmacother， 2002， 3(1): 23-31.

　　［6］ Du C， Khalil MW， Sriram S. Administration of dehydroepiandrosterone suppresses experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice［J］. J Immunol， 2001， 167(12): 7094-7101.

　　［7］ Duan RS， Link H， Xiao BG. Dehydroepiandrosterone therapy ameliorates experimental autoimmune myasthenia gravis in Lewis rats［J］. J Clin Immunol， 2003， 23(2): 100-106.

　　［8］ Offner H， Zamora A ， Drought H ， et al. A synthetic androstene derivative and a natural androstene metabolite inhibit relapsingremitting EAE［J］. J Neuroimmunol， 2002， 130(1-2): 128-139.

　　［9］ Zhu Y， Ljunggren HG， Mix E， et al. Suppression of autoimmune neuritis in IFNgamma receptordeficient mice［J］. Exp Neurol， 2001， 169(2): 472-478.

　　［10］ Weishaupt A， Brück W， Hartung T， et al. Schwann cell apoptosis in experimental autoimmune neuritis of the Lewis rat and the functional role of tumor necrosis factoralpha［J］. Neurosci Lett， 2001， 306(1-2): 77-80.

　　［11］ Dillon JS. Dehydroepiandrosterone， dehydroepiandrosterone sulfate and related steroids: their role in inflammatory， allergic and immunological disorders［J］. Curr Drug Targets Inflamm Allergy， 2005， 4(3): 377-385.

　　表2 淋巴细胞体外增殖反应（略）

　　Tab 2 T cell proliferation in vitro (cpm)

　　aP&<0.05 vs control group.

　　2.3 DHEA影响单个核细胞培养上清中细胞因子水平 应用ELISA检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞培养上清中IFNγ、 TNFα、 IL10水平。结果显示， 与对照组比较， DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组均能减少IFNγ和TNFα生成(P&<0.05)， DHEA 2 mg治疗组IFNγ和TNFα水平较0.5 mg 治疗组降低(P&<0.05); 各组间 IL10水平未显示明显的差异（表3）。

　　表3 BPM刺激单个核细胞培养上清细胞因子水平比较（略）

　　Tab 3 Levels of cytokine production by BPMrestimulated spleen cell supernatants

　　aP&<0.05vs control group.

　　3 讨论
　　
　　DHEA是人体内含量最丰富的类固醇， 已有许多研究证实DHEA或其代谢产物可调节Th1/Th3细胞免疫失衡， 可能对自身免疫性疾病有治疗作用［6， 7］。EAN是由外周神经髓磷脂或其蛋白质成分主动免疫或通过过继转移外周神经抗原特异性T细胞在易感啮齿类动物诱导的， 是CD4+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病。我们应用DHEA干预发病初期EAN（免疫后炎症阶段）， 结果显示， DHEA 0.5 mg/剂和2 mg/剂两种剂量均能抑制BPM诱导的单个核细胞增殖， 减少病灶局部及BPM刺激后单个核细胞培养上清IFNγ、 TNFα产生， 提示DHEA可抑制细胞免疫反应， 抑制Th1细胞功能。Du等［6］应用DHEA治疗SJL/J 小鼠过继转移性EAE， 可阻止病情进展， 降低脊髓促炎性细胞因子IFNγ、 IL12p40、 TNFα、 iNOSmRNA表达。Offner等［8］应用人工合成的DHEA衍生物HE2200和DHEA代谢产物HE2500预防性治疗SJL小鼠EAE， 两者均可减轻疾病严重程度， 降低血浆中PLP特异性抗体水平， 抑制PLP诱导的淋巴细胞增殖， 降低脊髓中TNFα、 TNFβ、 IFNγ、 MIP1α、 MCP1 mRNA表达。上述研究与我们的结论一致。
　　
　　外周神经内膜下T淋巴细胞、 巨噬细胞浸润及多灶性、 节段性髓鞘脱失是EAN的主要病理改变， 促炎细胞因子（IFNγ、 TNFα、 IL12、 NO等）在发病机制中起重要作用。外周神经内膜下浸润的T淋巴细胞释放IFNγ激活巨噬细胞， 后者通过吞噬作用和释放炎性细胞因子（如TNFα）， 直接损伤神经髓鞘。有证据表明， IFNγ在血清、 外周淋巴组织和周围神经中的水平与EAN临床症状相平行， IFNγ缺失小鼠抵抗EAN的发生［9］。TNFα被认为在免疫介导的髓鞘脱失中起直接作用， 向大鼠坐骨神经中注射TNFα， 导致神经内膜血管壁淋巴细胞聚积， 髓鞘脱失， 轴索变性［10］。提示IFNγ和TNFα在EAN发病中的关键作用。本研究显示， DHEA可降低全身和病灶局部IFNγ、 TNFα水平， 对IL10产生无影响。推测DHEA对EAN的治疗作用主要是下调Th1反应， 抑制促炎性细胞因子过度分泌， 对Th3细胞因子水平无影响。
　　
　　我们的实验结果显示， 与0.5 mg/剂治疗组比较， 2 mg/剂治疗组能明显减少单个核细胞培养上清IFNγ、 TNFα产生， 提示DHEA对免疫功能的影响存在剂量相关性。
　　
　　细胞因子生成过多是以Th1/Th3为基础的免疫失调的中心环节， 如何纠正机体的免疫失调， 是目前治疗自身免疫性疾病所面临的关键问题。虽然DHEA及其代谢产物在调节Th1/Th3细胞功能中的确切作用尚存在争议［11］， 但是上述实验结果表明， 该类分子是促炎性细胞因子过度表达的抑制剂， 可能对T淋巴细胞、 巨噬细胞等多种免疫细胞产生作用， 有希望成为治疗自身免疫性疾病的一种新手段。

参考文献

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　　［11］ Dillon JS. Dehydroepiandrosterone， dehydroepiandrosterone sulfate and related steroids: their role in inflammatory， allergic and immunological disorders［J］. Curr Drug Targets Inflamm Allergy， 2005， 4(3): 377-385.