FK228促进IL3介导的人红系前体细胞的增殖与分化

【摘要】 目的: 探讨组蛋白脱乙酰化酶抑制剂FK228在IL3介导的人红系前体细胞增殖与分化中的调节作用。方法: 经粒细胞集落刺激因子动员的肿瘤患者外周血单核细胞中分离CD34+细胞， 用含干细胞生长因子（SCF）、 白细胞介素3（IL3）或SCF+ IL3及不同浓度FK228的无血清培养液培养7 d， 分别用抗CD14、 GPA、 CD15及CD36单克隆抗体（mAb）染色并行流式细胞术（FCM）检测; 将CD34+细胞用含SCF、 IL3或SCF+IL3及FK228的半固体培养液培养， 并行细胞集落分析; 将CD34+细胞用含SCF+IL3的培养液培养7 d， 然后分离CD36+GPA-细胞， 将细胞用含有IL3+ FK228的半固体培养液中培养， 并行细胞集落分析。结果: FK228以一种剂量依赖方式促进CD36+细胞的产生， 对CD14+细胞及CD15+细胞的产生无明显影响; 0.5 μg/L FK228可明显增加含IL3培养体系中CD36+细胞的数量; FK228可明显增加含IL3的半固体培养基中集落形成的数量及组成单个集落的细胞数; FK228可明显促进CD36+GPA-细胞在含IL3的半固体培养基中形成红细胞集落。结论: FK228可促进白细胞介素3介导的人红系前体细胞的增殖与分化。

【关键词】 组蛋白脱乙酰化酶抑制剂 白细胞介素3 红系前体细胞 增殖 分化

　　组蛋白乙酰化和脱乙酰化在基因转录调节中起着非常重要的作用［1］。研究发现， 组蛋白乙酰化在造血分化过程有起动基因转录的作用［2］。例如， 参与不同谱系的造血细胞前体增殖和分化的转录共激活因子P300和CREB是一种组蛋白乙酰基转移酶［3］。此外。HDACs被发现可能参与急性髓系白血病的发生［4］。HDACs抑制剂已用于髓系白血病和其他血液性恶性疾病的治疗。在正常情况下应用HDACs抑制剂被报道可影响原始造血细胞前体的增殖， 脐血来源的红系前体细胞的分化及α球蛋白在成熟红细胞中的表达［5］。然而， HDACs在正常造血中的作用很大程度上是不知道的。本研究旨在利用HDACs抑制剂FK228探讨HDACs在成人造血中的作用， FK228是从色素杆菌中分离出来的一种天然多肽。FK228在培养液中比较稳定， 它是一种前体药物， 当进入细胞后才转化成为一种活性形式［6］。我们发现FK228可促进白细胞介素3介导人CD34+细胞分化成CD36+GPAlow不成熟红细胞， 但不影响髓系细胞的产生。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 重组人干细胞生长因子（SCF）、 红细胞生成素（EPO）和白细胞介素3（IL3）， 购自R&&D Systems公司。HDAC抑制剂FK228购自Fujisawa 制药公司。MACS CD34+免疫磁珠分离试剂盒（MACS）; 购自Miltenyi Biotec公司。PE标记的抗血型糖蛋白A （GPA， 红系祖细胞的一种标记分子 ）单克隆抗体(mAb)为(Becton Dickinson产品)， 抗CD14PE、 抗GPAPE、 抗CD15FITC、 抗CD36FITC抗体和鼠IgMFITC、 IgG2bPE Annexin VFITC 凋亡检测试剂盒(为BD Pharmingen公司); 流式细胞仪(Becton Dickinson Immunocytometry Systems， Mountain View， CA， USA)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CD34+细胞的分选 经患者知情同意后， 采集临床肿瘤患者经粒细胞集落刺激因子动员的外周血。利用MACS CD34+免疫磁珠按操作说明从单核细胞中分离CD34+细胞， 经过重复筛选后， CD34+细胞的纯度通常可超过95%。将CD34+细胞在24孔培养板中利用含有SCF+IL3的无血清培养液培养， 细胞因子按如下浓度使用: SCF 50 μg/L; IL3 10 μg/L; 在第3天进行半量换液。培养第7天， 用抗CD36F1TC和抗GPAPE对培养细胞进行染色。然后利用流式细胞术（FCM）分离CD36+GPA-和CD36+GPAlow细胞。

　　1.2.2 细胞培养 将CD34+细胞用含SCF、 IL3或SCF+IL3及FK228的无血清培养液在96孔板中进行细胞悬浮培养。培养3～4 d后， 进行半量换液。利用苔酚蓝染色对活细胞进行计数。对无血清的半固体培养， 将细胞接种于35 mm的培养皿中， 用IMDM培养液培养。经过10～14 d的培养， 对细胞数＜50个的和细胞数＞50个的红细胞集落进行计数， 红细胞集落根据其大小进一步分类。为了检测集落的类型， 挑取不同的类型细胞， 进行表型鉴定。

　　1.2.3 FCM分析 免疫荧光染色按文献［7］方法进行。所用抗体皆为鼠mAb: 抗CD14PE、 抗GPAPE、 抗CD15FITC、 抗CD36FITC、 鼠IgMFITC或IgG2bPE作为同型对照。利用FCM分析。利用PI染色排除死细胞。

　　1.2.4 凋亡分析 利用AnnexinVFITC凋亡检测试剂盒行AnnexinV/PI分析。简要步骤是将细胞用PBS洗涤后， 在含有annexinvFITC和PI的结合缓冲液中孵育15 min; 行FCM检测凋亡细胞和坏死细胞。

　　1.2.5 统计学分析 应用Student t检验进行分析， 以P＜0.05表示有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 FK228对CD36+红系、 CD14+单核系及CD15+粒细胞分化的影响 FK228随着浓度的递增对CD34+细胞分化为CD36+红系、 CD14+单核系和CD15+粒细胞的影响。经过7 d培养， FK228在IL3和SCF+IL3存在的条件下促进CD34+细胞分化为CD36+GPAlow细胞。FK228以一种剂量依赖方式促进CD36+细胞的产生， 最大剂量效应为0.5 μg/L（图1A）。在所有培养条件中， CD14+细胞没有或少见。尽管有少量CD15+细胞产生， FK228在浓度为0.5 μg/L时并不明显影响CD15+细胞的产生。

　　2.2 FK228可促进CD34+细胞分化为CD36+GPAlow不成熟红细胞 在含有SCF、 IL3或SCF+IL3的培养体系中0.5 μg/L FK228对CD34+细胞分化为CD36+红系细胞的影响。细胞培养7 d后， 在含有SCF和SCF+FK228的培养体系中没有观察到CD36+细胞的产生， 而在仅含有IL3的培养体中仅有少量的CD36+细胞产生， 而在该培养体系中加入FK228可明显增加CD36+细胞的数量。SCF和IL3联合应用比单独应用IL3更能促进CD36+细胞的产生， FK228在含有SCF+IL3的培养体系中也能促进CD36+细胞的产生（图1B）。业已证实， 红系前体细胞能表达GPA， 且随着分化进程， 表达也增强。为了评价FK228在红系前提细胞分化中的作用， 将CD34+细胞用含有IL3或SCF+IL3的培养液在加与不加FK228的条件下培养， 检测培养细胞CD36和GPA的表达。发现IL3和SCF+IL3可促进CD34+细胞分化为CD36+细胞， 该细胞不表达或低水平表达GPA， 表现出一种不成熟红细胞的表型。FK228增加2种培养条件中CD36+GPAlow/-细胞的比例。然而， FK228并不促进它们进一步分化为CD36+GPAhigh更加成熟的红细胞（图1C）。因此， 在含有IL3和SCF+IL3的培养体系中， FK228可促进CD34+细胞分化为CD36+GPAlow不成熟红细胞。

　　图1 FK228对CD34+细胞在IL3 和SCF+IL3存在的条件下分化为红系细胞的促进作用（略）

　　Fig 1 Stimulatory effect of FK228 on the generation of erythroid cells from CD34+ cells with IL3 and SCF+IL3

　　aP＜0.05 vs IL3＋FK228; bP＜0.01 vs SCF＋IL3＋FK228.

　　2.3 FK228促进CD34+细胞分化形成红细胞集落 为了阐明FK228在早期红系前体细胞分化中的作用， 将CD34+用含有SCF、 IL3或SCF+IL3及FK228的甲基纤维素培养液培养， 并分析红细胞集落的形成。利用抗CD36和GPA mAb染色来鉴定红系细胞集落。经过10～14 d的培养， 在含有SCF或SCF+FK228的培养液中没有集落形成。在仅含有IL3的培养液中， 主要是细胞数小于50红细胞集落的形成。而在其中加入FK228后可导致红细胞集落的数目明显增加（图2）。这些集落主要由CD36+GPAlow/-细胞组成。联合应用SCF和IL3可促进细胞数目较多的红细胞集落的形成。FK228也刺激CD34+细胞在含有SCF+IL3的培养体系中形成红细胞集落。而且， 在这些培养体系中， FK228明显增加单个集落的大小（图2B、 C）。这些结果显示， FK228在含有IL3或SCF+IL3的培养体系中增加红细胞对IL3的反应性， 从而促进早期红系前体细胞的生长。

　　图2 FK228对CD34+细胞在IL3 和SCF+IL3存在的条件下形成红系细胞集落的影响（略）

　　Fig 2 Effect of FK228 on erythroid colony formation by CD34+ cells with IL3 and SCF+IL3

　　bP＜0.01 vs IL3＋FK228; dP＜0.01 vs SCF＋IL3＋FK228.

　　2.4 FK228促进CD36+GPA-细胞分化形成红细胞集落 为进一步评价FK228在更加成熟的红系前体细胞生长中的作用， 将CD34+用含有SCF+IL3的培养液培养7 d， 然后分离CD36+GPA-细胞（图3A）。当将细胞在仅含有IL3的半固体培养基中培养时， 没有集落形成。但是， 当进入FK228以后， 可见到相当数量的红系集落的形成（图3B）。提示早期红系前体细胞在分化中丧失了对IL3的反应性， 但能被HDAC抑制剂部分逆转。

　　图3 FK228对CD36+GPA-细胞在IL3存在的条件下形成红系细胞集落的影响（略）

　　Fig 3 Effect of FK228 on erythroid colony formation by CD36+GPA- cells in the presence of IL3

　　3 讨论
　　
　　通过利用HDAC抑制剂FK228， 我们探讨了HDACS在成人红系前体细胞增殖和分化中的作用。我们发现FK228在含有IL3或SCF+IL3的培养体系中通过促进早期红系前体细胞的生长从而促进CD34+细胞分化为CD36+GPAlow/-不成熟红系细胞。我们的结果提示在含有IL3或SCF+IL3的无血清培养中， CD34+细胞可分化为CD36+GPAlow/-不成熟红系细胞。这些结果与以前的研究相一致， 即IL3联合SCF可促进早期红系前体细胞分化为βglobin+不成熟红系细胞［7］。FK228可促进CD34+细胞在含有IL3或SCF+IL3的培养体系中分化为不成熟红系细胞， 但并不促进其进一步分化为CD36+GPAhigh更加成熟红系细胞。FK228促进早期红系细胞前体对IL3和SCF+IL3的反应， 但在仅含有SCF时， 没有观察到类似的刺激作用。针对这些结果， 我们认为抑制HDAC的活性可增强早期红系前体细胞对IL3的反应性， 可刺激其分化成CD36+GPAlow/-不成熟红系细胞。在仅含有IL3的培养体系中没有观察到CD34+来源的CD36+GPA-细胞形成集落。然后， 加入FK228后， 这些细胞可经诱导形成相当数量的红系细胞集落。进一步提示， 尽管随着分化进程， 早期红系细胞前体丧失对IL3反应性［8］， 但这种反应性可以在红系细胞分化的早期通过抑制HDAC的活性得到部分的恢复。某些DNA结合抑制因子和HDACs可形成一种抑制复合物， 从而抑制靶基因的转录［9］。虽然具体的靶基因现在尚未明确， 可以想象该抑制因子可抑制与IL3介导的早期红系前体细胞生长相关基因的转录和抑制性调节它们对IL3的反应性。
　　
　　本研究显示由FK228介导的HDACs抑制对红系前体细胞的增殖和分化具有明显的作用， 在此剂量下对粒细胞的分化没有明显的影响。在FK228的临床试验中， 运用FK228可导致迅速的中性细胞减少和血小板减少， 但仅观察到轻度的贫血， 可能的原因是在体条件下， FK228在红系造血中的作用被其刺激和抑制因素所平衡［10］。总之， 本研究明确了HDACS在成人红系造血中的重要作用以及HADC抑制因子作为造血调节因子所具有的潜在治疗价值。

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