CTL前体频率对CD8+ CTL应答类型的影响

【摘要】 目的: 探讨CTL前体的频率对CTL应答类型的影响。方法: 用重组鼠IL4和GMCSF诱导小鼠骨髓来源DC发育成熟， 卵清蛋白Ⅰ（OVAⅠ）多肽激活DC， 流式细胞术（FCM）分析DCOVA表型; 用OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA接种Iab-/- C57BL/6小鼠， FCM检测小鼠体内OVA特异性CTL及特异性CTL对OVA特异性脾细胞的体内细胞毒作用， 并观察DCOVA免疫后小鼠肺肿瘤的生长情况。结果: 经OVAⅠ多肽刺激后， DC表面有高水平CD11c、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb分子及pMHCⅠ复合体表达; 注射不同剂量（0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106）OVA特异性CD8+ T细胞后， 小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%， 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高（P&<0.05）， 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL为2.45%±0.22%; 各剂量组CFSElow细胞数不变， CFSEhigh细胞随着CD8+ T细胞数的增加而逐渐减少， 小鼠肺肿瘤数随接种CD8+ T细胞数的增加而减少（P＜0.05）。结论: 增加CTL前体频率可使CTL应答类型由CD4+ T细胞依赖型转变为CD4+ T细胞非依赖型。

【关键词】 CTL前体 频率 CTL应答 CD4+ T细胞

　　CD8+ T细胞通过细胞膜表面的T细胞（TCR）识别特异性抗原而活化、 增殖、 分化为细胞毒性T细胞（CTL）， 对靶细胞发挥特异性杀伤作用。正常情况下， 细胞毒性T细胞的活化依赖于CD4+ T细胞的辅助。CD4+辅助性T细胞（Th）接受抗原提呈细胞（APC）提呈的抗原活化以后可分泌细胞因子和表达共刺激分子， 辅助CD8+ T细胞的活化。然而有研究报道， 许多病毒在缺乏Th细胞的条件下仍可刺激机体产生特异性的CTL免疫［1， 2］。表明CD8+ T细胞可通过某种信号方式活化其自身， 而这种信号的加强要求足够数量的CD8+ T细胞。我们通过给CD4+ Th细胞缺陷小鼠注射卵清蛋白（ovalbumin， OVA）特异的CD8+ T细胞， 探讨CTL前体频率对CTL免疫应答的Th细胞依赖性的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 OVAⅠ多肽为SIINFEKL公司产品。FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和H2 Kb/OVAⅠ复合物（pMHCⅠ）抗体为Pharmingen公司产品。PE标记的抗鼠H2 Kb/ OVA257264抗体购自Beckman Coulter公司。重组鼠IL4和GMCSF为R＆D公司产品。荧光染料CFSE为Molecular Probes公司产品。MO4为转OVA基因的黑色素瘤细胞， 具有高度肺转移特性， 由本室保存。OVA特异的TCR转基因OTⅠ小鼠和野生型C57BL/6小鼠（B6; CD45.2+）、 Iab缺陷型（Iab-/-）C57BL/6小鼠（雌性， 体质量23～30 g， 6～8周龄）由Jackson实验室引进。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠骨髓来源DC的培养及激活 CO2窒息法处死小鼠， 无菌条件下取小鼠股骨、 胫骨， PBS冲洗骨髓至髓腔变白， 收集冲洗液， 1 500 g离心5 min， 收集细胞用PBS洗2次。TrisNH4Cl裂解红细胞， 用含20 μg/L GMCSF、 1 μg/L IL4的DMEM培养基重悬细胞至2×109/L， 按每孔4 mL加入24孔板， 置37℃、 50 mL/L CO2培养。第3天更换培养液，轻轻晃动培养板， 弃去上清， 补入含细胞因子的DMEM完全培养液。第6天细胞换液， 用吸管轻轻冲洗， 收集上清， 1 500 g离心5 min， 用含20 μg/L GMCSF、 1 μg/L IL4 和15 μg/L TNF的DMEM培养液重悬细胞， 继续培养24 h后收集细胞， 换无血清的AIMV培养液， 加入OVAⅠ多肽（0.3 g/L）， 置37℃、 50 mL/L CO2培养过夜， 次日收集细胞进行表型鉴定。

　　1.2.2 OVA特异性CD8+ T细胞的分离 CO2窒息法处死OTⅠ小鼠， 无菌分离脾脏， 置于盛有适量无菌PBS的小平皿中， 经200目钢网研磨， 制成单个细胞悬液。PBS洗2次。用 RPMI1640培养液重悬细胞， 加入尼龙毛柱中， 常规培养1 h， 收集流出的T淋巴细胞， PBS洗2次， 然后将细胞悬浮于PBS中， 采用免疫磁珠结合的抗CD4单克隆抗体（mAb）阴性选择法（按说明书进行操作）去除CD4+ T细胞， 富集CD8+ T细胞。

　　1.2.3 DC表型分析 收集经OVAⅠ刺激的骨髓细胞， 用PBS悬浮为1×109/L， 加入流式细胞术（FCM）测定管， 每管1 mL， PBS洗2次， 离心去上清后加入PBS 100 μL， 分别加入FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和pMHCⅠ抗体1 μL。混匀后于4℃避光孵育30 min， PBS 洗2 次， FCM分析。

　　1.2.4 CD8+ T细胞接种小鼠 OVA特异CD8+ T细胞以不同剂量（0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106）经尾静脉接种Iab-/-C57BL/6小鼠， 每个剂量组10只， 野生型C57BL/6小鼠作为对照未接种CD8+ T细胞， 第2天野生型及Iab-/-C57BL/6小鼠均尾静脉接种DCOVA（0.5×106/只）， 第7天采血检测OVA特异性CTL， 次日尾静脉注射MO4细胞（1×106/只）， 每个剂量组注射5只小鼠（另外5只用于体内细胞毒实验）， 21 d后杀死小鼠肉眼观察小鼠肺肿瘤生长情况， 计数肿瘤数目。

　　1.2.5 小鼠体内OVA特异CTL的检测 小鼠断尾取血50 μL， 加入10 μL PE标记的H2 Kb/OVA257264试剂， 混匀， 室温避光孵育30 min， 加入1 μL FITC标记的抗CD8 mAb， 室温避光孵育30 min， 再加入红细胞裂解液， 室温避光作用30 min后用含5 g/L BSA的PBS洗2次， FCM分析。

　　1.2.6 体内细胞毒实验 CO2窒息法处死C57BL/6小鼠， 无菌取脾脏， 制备脾细胞悬液， 用无血清RPMI1640培养液调整细胞密度为5×109/L， 加入15 mL离心管， 每管10 mL， 分别加入CFSE使其终浓度为0.6 μmol/L和3.0 μmol/L， 制备CFSElow细胞（0.6 μmol/L）和CFSEhigh细胞（3.0 μmol/L）， CFSEhigh细胞加入OVAI多肽， 置37℃、 50 mL/L CO2孵育1 h。1 500 g离心5 min， PBS洗2次， 再将CFSElow细胞和CFSEhigh细胞按15∶19比例混合， 注射上述经OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫的小鼠（1×106/只）， 每个剂量组5只， 16 h 后制备脾细胞悬液FCM分析。

　　1.2.7 统计学处理 实验数据用x±s表示， 应用SPSS11.5统计分析软件进行方差分析。P＜0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 活化DC表面膜分子的表达 小鼠骨髓细胞培养7～8 d后， 镜下可见细胞具有典型的DC形态， 经细胞计数和FCM鉴定其纯度达85%以上， 细胞表面CD11c表达率为90.5%， CD80表达率为79.8%， CD54表达率为81.2%， Iab表达率为71.3%， Kb表达率为83.1%， pMHCⅠ复合体表达率为69.6%（图1）。表明细胞为活化DC（即DCOVA）。

　　图1 OVAⅠ多肽激活的DC表面分子的分析（略）

　　2.2 小鼠体内OVA特异性CTL的检测 不同浓度CD8+ T细胞接种Iab-/-小鼠， 第2天接种DCOVA， DCOVA免疫后第6天采血检测OVA特异CTL， FCM分析结果显示， 注射不同浓度CD8+ T细胞后， 小鼠外周血OVA特异CTL（即H2 Kb/OVA257264、 CD8双阳性细胞）占CD8+ T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%， 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高（P&<0.05）。未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL百分比为2.45%±0.22%（图2）。

　　图2 CTL前体频率对OVA特异性CTL的影响（略）

　　2.3 体内细胞毒实验 OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫后第6 天小鼠尾静脉注射CFSElow和CFSEhigh混合细胞， 16 h后制备脾细胞悬液， 经FCM分析， 结果显示， 各剂量组CFSElow细胞不变， 相对数均为100， 未接种CD8+ T细胞的Iab-/-小鼠CFSEhigh细胞相对数为99， 随着注射CD8+ T细胞数的增加， CFSEhigh细胞逐渐减少， 表明小鼠体内产生了OVA特异性免疫， 对照组C57BL/6小鼠的CFSEhigh细胞为43（图3）。

　　图3 OVA特异性CTL的体内细胞毒作用（略）

　　2.4 特异性CTL对小鼠肺肿瘤生长的影响 MO4细胞尾静脉注射OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫的小鼠， 21 d后杀死小鼠， 于小鼠肺脏表面可见大小不等的褐色肿瘤生长， 随着注射的CD8+ T细胞数的增加， 肿瘤数减少（P＜0.05）， 注射1×106、 5×106 CD8+ T细胞组未见肿瘤生长（图4、 5）。

　　图4 注射CD8+ T细胞对Iab-/-小鼠肺肿瘤生长的影响（略）

　　A: 未接种CD8+ T细胞; B: 注射1×106 CD8+ T细胞.

　　3 讨论
　　
　　CD8+ T细胞在抗肿瘤及抗细胞内感染免疫中发挥重要的作用。通常情况下， CD8+ T细胞的活化需要Th细胞的辅助［3， 4］。然而许多病毒可刺激CTL免疫而不需Th细胞的辅助， 表明CD8+ T细胞可通过某种信号方式活化其自身， 而这种信号的加强要求足够数量的CD8+ T细胞。为了探讨CD8+ T细胞频率对CTL应答类型的影响， 我们从OTⅠ小鼠分离OVA特异的CD8+ T细胞， 以不同剂量注射Iab-/-小鼠， 同时注射相同剂量DCOVA， 5 d后检测小鼠体内OVA特异性CTL。OTⅠ小鼠为OVA特异性TCR Vα2Vβ5转基因的C57BL/6小鼠［5］， 将其脾细胞过尼龙毛柱去除B淋巴细胞， 再采用免疫磁珠结合的抗CD4 mAb阴性选择法去除CD4+ T细胞， 可获得纯度大于98%的OVA特异的CD8+/Vα2Vβ5 T淋巴细胞。Iab-/-小鼠由于其MHCⅡ类分子Iab缺陷导致体内缺乏能辅助OVA特异性CD8+ T细胞活化的CD4+ T细胞［6］。

　　图5 OVA特异性CTL对Iab-/-小鼠肺肿瘤生长的影响（略）

　　本研究结果显示， 未注射T细胞的Iab-/-小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比为0.01%， 注射不同浓度 OVA特异CD8+ T细胞后， OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为1.31%、 2.34%、 3.11%、 4.23%; 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠OVA特异CTL百分比为2.45%。提示在Th细胞缺陷的Iab-/-小鼠由于体内OVA特异CTL前体频率极低， 虽有DC的抗原提呈作用亦不能刺激产生特异CTL应答。相反， 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠由于体内有OVA特异Th细胞存在， 给予DCOVA刺激后可诱导产生特异CTL免疫。给Iab-/-小鼠注射OVA特异CD8+ T细胞后， 在缺乏特异性Th细胞的条件下有效诱导了特异性CTL应答。表明增加CTL前体频率可使CTL应答类型由Th细胞依赖型转变为Th细胞非依赖型。为了验证这些CTL的细胞毒活性， 我们给小鼠注射CSFE标记［7］的CFSElow脾细胞和OVA特异CFSEhigh脾细胞， 通过FCM分析特异性CTL免疫对OVA致敏的CFSEhigh细胞的杀伤作用。结果显示， 随着注射的CD8+ T细胞数目的增加， 小鼠体内CFSEhigh细胞逐渐减少。进一步通过肿瘤攻击动物实验证实， 随着注射的CD8+ T细胞数的增加， 小鼠肺肿瘤生成减少， 表明小鼠体内产生了OVA特异性CTL免疫。本实验证实了增加CTL前体频率可使CTL应答类型由Th细胞依赖型转变为Th细胞非依赖型， CD8+ T细胞通过什么方式活化其自身有待进一步研究。

参考文献

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　　［7］ 陈蕾蕾， 陈军浩， 孙雪梅， 等. 荧光染料CFSE作为细胞标记的特性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2004， 20（2）: 140-141.