靶向肿瘤血管的抗体免疫治疗

【摘要】 肿瘤细胞引起多样性和易突变性很难直接用药物治疗， 并且肿瘤细胞的耐药性也已成为治疗的一个瓶颈。靶向肿瘤血管的抗体治疗通过靶向实体肿瘤内血管内皮细胞生长增殖的相关靶点， 切断肿瘤细胞的营养供应从而达到治疗肿瘤的目的。本文中总结了近年来世界各国已上市或处于临床阶段及实验室阶段的靶向肿瘤血管抗体药物， 并阐述了该治疗策略的特点及部分抗体药物的作用机制， 提出目前存在的问题和相关解决方法， 为靶向肿瘤血管的抗体治疗研究提供一定的参考。

【关键词】 靶向肿瘤血管 抗体药物 免疫治疗

　　肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管的形成， 各种实体肿瘤依靠其内部血管提供营养物质和排泄代谢废物， 因此通过抑制、 阻断或破坏肿瘤血管的形成能够抑制实体肿瘤的生长。Folkman早在30 多年前就提出肿瘤的生长依赖于新生血管形成， 阻断其血管形成可有效治疗肿瘤［1］。通过对肿瘤血管形成机制和肿瘤血管内皮细胞生物学特性的深入研究， 人们发现肿瘤血管内皮细胞由于受多种生长因子刺激而增生活跃， 它们的抗原表达也不同于机体正常组织内血管内皮细胞， 能够在胞膜上相对特异地表达一些抗原［2］。用这些抗原的相应抗体与其他物质， 如细菌蛋白、 植物毒素或放射性核素等融合制备成免疫复合物， 可特异地破坏肿瘤血管内皮细胞， 从而发挥靶向治疗作用， 称为靶向肿瘤血管的抗体免疫治疗［2］。

　　1 肿瘤血管的形成与肿瘤的关系
　　
　　传统观点认为， 恶性细胞转化和肿瘤的发生发展源于细胞内DNA多种突变导致的癌基因的过度活化和抑癌基因的失活。然而， 单纯的细胞转化并不足以引起肿瘤发生。研究发现在癌基因未活化之前， 潜在的血管形成抑制因子THBS1的活性较高［3］。在随后的实验中进一步发现， 虽然癌基因能够促使肿瘤迅速增长， 但是诱导癌基因失活后， 肿瘤并不消失。若重新导入THBS1并使其表达， 则肿瘤变小［4］。因此， Folkman提出肿瘤的生长依赖于新生血管的形成， 抗血管生成药物可与化疗药物同时使用以达到理想的效果［3， 5］。
　　
　　肿瘤发生早期， 可通过组织渗透维持生长， 当其直径超过1～2 mm后， 必须依靠新生血管提供营养维持生长。肿瘤血管的形成一方面可以在原有微血管的基础上形成新生毛细血管。新生血管内皮细胞的增殖更新速度远远大于正常成熟组织的血管系统， 主要原因是维持血管状态的促血管生成因子和抑制血管生成因子间的平衡被打破， 促血管生成因子活性上调， 血管基底膜中的金属蛋白酶、 组织纤溶酶原激活剂等多种水解酶活性上调， 基底膜与细胞外基质降解、 重塑， 进而血管内皮细胞生长因子受体表达升高， 在相关基因的作用下， 通过促进和松弛内皮细胞与周围支持细胞（如平滑肌细胞、 成纤维细胞等）的相互作用从而完成血管的形成［5］。另一方面， 肿瘤组织中的血管内皮细胞来源于骨髓或循环系统中的内皮细胞前体细胞， 它们在肿瘤部位某些因子如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等的刺激下分化为内皮细胞， 进而形成血管样结构。
　　
　　肿瘤血管与正常生理条件下形成的血管相比， 在结构、 细胞组成及形成过程的时空调控均存在较大差异。结构上， 肿瘤新生血管管壁薄弱， 缺乏平滑肌及完整的基底膜结构， 有大量的血管盲端、 动静脉间短路等; 内皮细胞之间存在较大缝隙， 通透性强， 易于癌细胞穿透转移。因此， 在组成上， 肿瘤细胞和内皮细胞可以相间排列在肿瘤血管腔内表面。调控上， 血管生成促进因子主要有血管内皮生长因子（VEGF）、 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、 转化生长因子（TGF）、 内皮抑素（endostatin）等， 并且细胞间黏附分子如选择素E（Eselectin）等也起促进血管生成的作用［6］; 抑制因子有部分来自一些蛋白质的水解片断， 如纤溶酶原降解片段Angiostatin等。
　　
　　基于肿瘤血管与正常组织血管之间蛋白及基因表达水平上的差异， 可以这些差异为靶点， 筛选能作用于肿瘤血管的特异性药物， 阻断血管形成并破坏已形成的血管， 从而达到治疗肿瘤的目的。

　　2 靶向肿瘤血管的抗体药物
　　
　　传统肿瘤治疗方法一般是通过手术直接切除肿瘤或应用药物和放疗化疗杀伤肿瘤细胞， 但其效果不佳且给机体带来较大损伤。目前， 药物治疗是肿瘤治疗的一个主要方法， 但其疗效受到多种因素的制约， 如药物的穿透性问题、 对靶细胞的选择性不佳等， 并且肿瘤细胞的抗药性已成为最大的制约因素。

　　2.1 靶向肿瘤血管的抗体免疫治疗的特点 目前， 依靠特异性抗体的靶向技术治疗肿瘤已经成为研究热点（目前已上市、 处于临床试验及部分实验室研究的靶向肿瘤血管抗体药物见表1）。根据靶向部位的不同， 可以将肿瘤靶向治疗分为二大类， 即肿瘤细胞靶向治疗和肿瘤血管靶向治疗。实体瘤占人类恶性肿瘤的90%， 采用抗肿瘤细胞的特异性抗原制备单克隆抗体（mAb）连接免疫毒素可特异杀死肿瘤细胞， 但临床试验效果并不显著， 仅对淋巴瘤和白血病患者有一定的效果。主要原因可能因为实体瘤细胞被致密的基质包裹， 抗体难以穿透这一屏障。另外， 小部分进入肿瘤内的抗体首先与实体肿瘤血管周围的肿瘤细胞结合， 使得几乎没有抗体能够到达距血管较远处的细胞［7］。因此， 注射的免疫毒素一般只有0.001%～0.01%到达实体肿瘤组织内［8］。与之不同的是， 肿瘤血管靶向治疗由直接攻击肿瘤细胞本身转向肿瘤内的血管内皮细胞。首先， 肿瘤内血管内皮细胞表面抗原能直接与其特异性抗体接触， 抗体偶联药物易于发挥作用; 其次， 不同类型的实体瘤血管内皮细胞生物学特征和抗原表达相似， 易于找到一种能够对多种实体瘤有效的靶向药物; 第三， 内皮细胞比肿瘤细胞的基因组相对稳定， 不容易产生抗药性。

　　表1 目前已上市、 处于临床试验及部分实验室研究的靶向肿瘤血管抗体药物（略）

　　2.2 靶向VEGF的抗体药物 VEGF是糖基化碱性蛋白， 由两个相同分子质量(Mr 17 000～23 000) 亚基以二硫键结合形成的二羟聚体， 其Mr为34 000～46 000。通过对VEGF mRNA不同的方式剪切， 可以产生VEGF121、 VEGF145、 VEG2F165、 VEGF189、 VEGF206 5种不同形式的异构体。血液中检测到的主要是VEGF165及VEG2F121。现已发现的VEGF 受体（VEGF receptor， VEGFR）有VEGFR1（flt1）、 VEGFR2（flk1/KDR）和VEGFR3（flt4）， 均为酪氨酸激酶受体。VEGFR1和VEGFR2可以和所有的VEGF结合， VEGFR3 则只和VEGFC、 VEGFD 结合。通过与受体的结合， VEGF能够增强血管内皮细胞有丝分裂和迁移， 增加血管尤其是微小血管的渗透性， 并且具有促进淋巴管形成及肿瘤淋巴转移的作用。
　　
　　目前的抑制血管生成的药物取得显著疗效的是Bevacizumab（Avastin， 贝戈mAb）。由Genentech公司开发的一种抗血管内皮生长因子的人源化mAb， 无论是单独使用或与其他化疗药物联合使用， 贝伐mAb均可减少肿瘤血管生成。其Ⅲ期临床试验已经获得成功， 对800多名肿瘤已发生转移的结肠直肠癌患者进行的临床试验发现， 同时接受Bevacizumab和化疗治疗的患者， 与只接受化疗的患者相比存活期平均要长5个月左右。2004年2月26日Bevacizumab上市作为治疗恶性结肠直肠癌的一线用药， 成为第一个被美国FDA批准通过抑制血管生成发挥抗癌作用的新药。不过， 临床试验中也发现， 该药物会导致高血压等副作用， 最严重的不良反应为胃肠穿孔和伤口并发症， 并出现了因服用Bevacizumab致肠穿孔而死亡的临床病例。除此之外， VEGF的mAb 3E7、 GV39M、 2C3 等都是抑制肿瘤血管生成的候选药物。它们都能与防止VEGF激活VEGFR， 其中3E7和GV39M能够选择性的结合肿瘤内皮细胞; 2C3阻断VEGF介导的内皮细胞增殖［9］。

　　2.3 靶向VEGFR的抗体药物 血管内皮生长因子受体Ⅱ， 又称激酶功能区受体(vascular endothelial growth factor Ⅱ， VEGFR2/kinase domain receptor， KDR) 存在于肿瘤新生血管内皮细胞表面， 与VEGF结合介导肿瘤新生血管形成， 研究表明阻断VEGF与VEGFRⅡ的相互作用能够抑制动物体内实体瘤的生长， 达到治疗肿瘤、 抑制肿瘤生长的目的。
　　
　　IMC1C11是ImClone公司研制的一种人鼠嵌合IgG抗体， 能与可溶性KDR和细胞表面KDR胞外区特异性结合阻断VEGF与KDR的相互作用， 其鼠的部分来源于一个小鼠抗体文库中分离的Fv单链［10， 11］。IMC1C11通过抑制VEGF激活KDR和KDR酪氨酸激酶途径， 阻断VEGF诱导的内皮细胞的有丝分裂。为了完全避免异源性抗体给人体带来的危害， Lu等［12］以人的B淋巴细胞为库源构建了噬菌体抗体库， 从中筛选出的人Fab片段在nmol/L级即可与KDR特异性结合， 阻断VEGF对KDR的激活作用。实验发现， 该抗体能够有效抑制VEGF诱导的人胚胎脐静脉内皮细胞的分裂， 为抗人KDR抗体治疗肿瘤奠定了基础。

　　2.4 靶向Endoglin的抗体药物 Endoglin又名CD105或EDG， 是内皮细胞增殖相关的膜抗原， 属转化生长因子β（TGFβ）超家族受体复合物的组成成分， 可调节细胞对TGFβ的反应， 参与血管形成， 与肿瘤血管的产生密切相关。Endoglin的Mr为180 000， 主要表达于人类的血管内皮细胞、 胎儿的滋养层细胞， 正常的B淋巴细胞、 T淋巴细胞以及未受刺激的单核细胞并不表达。在肿瘤组织边缘血管中Endoglin过度表达， 且较vWF， CD31和CD34更具有特异性， 而在正常组织的大血管并不表达［14］。
　　
　　Philip等［15］用结肠癌细胞的条件培养液刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）， 然后用此HUVEC免疫小鼠， 再制备出一种抗Endoglin的mAb TEC11。通过研究发现TEC11与绝大多数肿瘤组织的血管内皮细胞发生强力反应， 如乳腺癌、 肺癌、 结肠癌、 霍奇金病等， 而大多数正常组织的血管内皮细胞与TEC11则无反应或反应较弱。进一步研究发现， TEC11与处于早期侵袭阶段的肿瘤血管内皮细胞的反应较晚期阶段强; 与静止的内皮细胞相比， TEC11与分裂增殖的内皮细胞反应更强。分裂增殖的内皮细胞与静止内皮细胞表达不同的Endoglin异构体， 导致了TEC11与这两种细胞不同的反应。当静止的内皮细胞被激活增殖时， 它们与TEC11的反应增强。Tabata等［16］采用125I标记的抗Endoglin的mAb SN6f和SN6j静脉分别在3、 5、 7 d和58、 60、 62 d注射荷MCF7人乳腺癌SCID小鼠， 结果显示125ISN6f和125ISN6j治疗组较对照组有显著的抑瘤效果， 且无明显的毒副作用和体重下降。

　　3 靶向肿瘤血管的抗体免疫治疗中存在的问题
　　
　　在靶向肿瘤血管的抗体治疗研究过程中， 主要有以下几个方面成为该策略发展的瓶颈: 缺乏对抗原本身表达调控理论认识， 如对CD105本身的调控表达并不清楚; 靶向抗原的特异性抗体需要偶联细菌蛋白、 植物毒素或放射性核素， 可能本身会造成机体损伤; 停止用药后， 抗体治疗主要是通过切断肿瘤细胞的营养来源起到杀死肿瘤细胞的目的， 但这种手段往往不能彻底杀死全部肿瘤细胞， 剩余细胞容易在停药后复发。在实验上， 肿瘤血管内皮细胞的分离、 纯化、 体外培养技术尚不成熟， 高通量制备、 筛选、 鉴定肿瘤血管内皮细胞功能性抗体技术有待进一步提高， 缺乏能在体内评价抗人肿瘤血管生成药物的动物模型等。
　　
　　针对目前存在的主要问题， 不同的实验室提出多种解决方案。如寻找新的靶点， 这一方面我国阎锡蕴教授实验室走在前列［18］; 使用全人抗体降低免疫原性; 寻找放射性核素的替代物; 针对治疗后产生的负反应， Folkman提出低剂量节律性给药方案［19］; 多药联合治疗， 即同时采用化疗药物和靶向肿瘤血管的抗体药同时治疗等措施。

　　4 展望
　　
　　基于靶向肿瘤血管的抗体治疗研究不仅能给我们带来治疗肿瘤的新方法， 还对其他多个与肿瘤相关的领域均起促进作用。如抗肿瘤血管内皮细胞的mAb， 即可用于肿瘤病理诊断和肿瘤影像学诊断， 也可以检测肿瘤的微血管密度， 有利于判断肿瘤的预后， 还可根据其表达强弱可判断肿瘤的侵袭能力， 为临床选择治疗方法提供参考依据。无庸置疑， 随着对肿瘤血管发生发展机制研究的深入及临床经验的积累， 靶向肿瘤血管的抗体免疫治疗将在肿瘤的治疗中扮演越来越重要的角色。

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