人抗体Fab段天然抗体库的建立

　　　　 作者：韦晓明， 苏明权 杨安钢， 温伟红， 郝晓柯

【摘要】 目的: 提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA， 利用反转录PCR方法， 建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。方法: 收集健康者外周血， 提取淋巴细胞， 以淋巴细胞mRNA为模板， 扩增人抗体Fab段， 连入载体pComb3内， 利用电转化的方法， 构建噬菌体抗体库。结果: 最终建立了重链库为1.73×107， 轻链库为8.52×104的天然抗体库， 并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库1.21×107， 轻链库4.26×104， 所以理论上所建天然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。结论: 成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。

【关键词】 天然抗体库; Fab; 反转录PCR

　　自1975年单克隆抗体(mAb)问世以来［1］， mAb已广泛应用于临床疾病的诊断、 防治及基础理论研究等领域， 取得了令人鼓舞的结果。但鼠源性抗体用于人体防治会产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody， HAMA）， 它不仅使治疗用mAb迅速失去效用， 而且会引起过敏反应。为此这些年来， 人们一直致力于鼠源mAb的人源化的工作。噬菌体抗体库是近十几年来发展的一种新的技术［2， 3］， 它使mAb的应用得到了进一步的推广， 而且被广泛应用于mAb人源化， 抗体亲和力提高等技术中。本研究中我们使用电转化的方法建立了大容量的人抗体Fab段天然抗体库， 从而为进一步的抗体人源化工作打下良好的基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心; TRIzol reagent、 反转录试剂盒购自Promega公司; DEPC购自Sigma公司; 引物合成由大连宝生物公司合成; mRNA纯化试剂盒、 Taq DNA聚合酶购自Invitrogen; DNA凝胶纯化试剂盒购自上海华舜公司; 蛋白胨、 酵母提取物购自Oxoid公司; E.coli XL1Blue菌株为本室保存; 载体pCOMB3由杨洁硕士馈赠。LB（蛋白胨10 g/L、 酵母提取物5 g/L、 NaCl: 10 g/L， pH7.0）、 GYT（丙三醇100 mL/L、 酵母提取物1.25 g/L、 蛋白胨2.5 g/L， pH7.0）、 SOC（蛋白胨20 g/L、 酵母提取物5 g/L、 NaCl 0.5 g/L、 2.5 mmol/L KCl、 10 mmol/L MgCl2、 20 mmol/L 葡萄糖， pH7.0）等培养基为本室配置。PCR仪购自PE公司; 电泳仪购自BIORAD公司; 台式高速离心机购自上海安亭科学仪器厂; 高速冷冻离心机购自湖南仪表仪器总厂离心机厂; 紫外分光光度仪购自Beckman公司; BIORAD gene pulser II 电脉冲基因转移仪购自BIORAD公司。

　　引物设计［2］: Fd5′引物: 5′SAG GTG CAG CTC GAG SAG TCT GGG3′; 5′SAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG3′。Fd3′引物: 5′GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG3′; 5′CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT 3′; 5′TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT3′; 5′GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA3′。κ链5′引物: 5′GAM ATY GAG CTC ACS CAG TCT CCA3′。κ链3′引物: 5′GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCA AG3′; 5′GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG ATC TCA G3′。λ链5′端引物: 5′CAS TYT GAG CTC ACK CAR CCG CCC TC3′。λ链3′端引物: 5′GAG GGA TCT AGA TTA TGA ACA TTC TGT AGG3′。 S=C or G; M=C or A; Y=C or T; K=G or T; R=A or G。

　　1.2 方法

　　1.2.1 淋巴细胞分离 2 300名志愿者（2003/2004年本院健康体检者）抽取外周血1 150 mL， 与淋巴细胞分离液以1∶1的比例混合， 离心分离中层淋巴细胞。

　　1.2.2 RNA提取 使用1010细胞/L TRIzol比例裂解淋巴细胞， 提取总RNA。然后根据mRNA纯化试剂盒提供的方法从中提取mRNA。

　　1.2.3 反转录及其扩增 将纯化的mRNA按照反转录试剂盒提供的方法全部用来反转录， 以获得的cDNA为模板， 进行PCR扩增抗体Fd、 κ和λ片段编码区。PCR条件为: Fd: 94℃ 5 min热启动， 94℃ 1 min变性， 52℃ 1 min退火， 72℃ 2 min延伸， 共35 Cycles。 最后进一步延伸7 min。反应体系为100 μL。κ和λ: 94℃ 5 min热启动， 94℃ 1 min变性， 56℃ 1 min退火， 72℃ 2 min延伸， 共35 Cycles。 最后进一步延伸7 min。反应体系为100 μL。

　　1.2.4 质粒提取 pCOMB3载体按回收纯化试剂盒说明进行提取纯化， 700 mL/L乙醇沉淀浓缩， 并用紫外分光光度计测定含量。以250 mg/L 浓度-20℃储存备用。将载体和PCR产物分别经过Spe I＋Xho I双酶切和Sac I＋Xba I双酶切， 连接在一起， 回收连接产物。

　　1.2.5 抗体库建立 将1～2 μL连接产物加入到50 μL电转化感受态中， 混匀后转入冰浴的电转化杯中， 进行电转化， 电击后的细胞立即倒入1 mL SOC培养液中， 37℃、 150 r/min培养1 h， 然后取1/1 000或1/10 000菌液倍比稀释后涂布于含氨苄青霉素50 mg/L平板， 37℃过夜培养， 计数菌落， 计算转化率（转化子/μg DNA）。

　　2 结果

　　2.1 Fd段、 κ链、 λ链PCR扩增结果 将获得mRNA全部反转录， 所得cDNA为模板进行PCR， 结果如图1所示。

　　图1 Fd段、 κ链、 λ链PCR扩增结果

　　1: Fd段PCR产物; 2: κ链PCR产物; 3: λ链PCR产物; M: DNA markers.

　　2.2 抗体库的建立 将连接产物进行电转化， 将转化后菌液涂布氨苄青霉素平板， Fd库以1/1 0000的比例涂板， 轻链库以1/100的比例涂板， 计数平板上的菌落， 假设一个菌落为一种抗体， 计算转化率。最终建立重链库1.73×107， 轻链库8.52×104。这样， 总的库容量可以达到1.47×1012。将转化后菌液用SOC扩大培养， -70℃储存。

　　2.3 抗体库的鉴定 为了保障抗体库的库容量， 对所建成的抗体库进行了鉴定。将抗体库取10 μL， 100倍稀释， 涂布平板， 挑取单个克隆， 摇菌过夜， 提取质粒， 做酶切鉴定。每个库随机挑取10个单克隆(图2)。从图2可以看出， 重链库中有70%正确克隆， 所以实际的库容量为1.21×107。轻链库中有50%正确克隆， 所以实际库容量为4.26×104。实际的总库容量为5.15×1011。

　　图2 Fd段库、 轻链库酶切鉴定

　　1-10: Fd段库酶切鉴定; 11-20: 轻链库酶切鉴定; M: DNA markers.

　　3 讨论

　　要构建大库容量的抗体库， 淋巴细胞的量至少要达到107以上， 因为人类天然抗体库的重链即有107的多样性。只有淋巴细胞的量达到这个数量级， 才有可能将每一种抗体基因都扩增出来。本研究从1 150 mL的外周血分离的淋巴细胞共计约2.3×109， 这为成功地构建大库容量的抗体库提供了基本的保证。为了尽可能全面的扩增出抗体家族的各成员的抗体片段， 本研究选择合成了11条引物。此外在人体体内， 轻链为λ链的抗体占到了40%， 所以也合成了λ的引物， 争取在扩增过程中减少遗漏。所有的模板只进行一次PCR扩增， 这样可以保证抗体的多样性， 避免在最后建库的过程中， 出现大量重复克隆。减少PCR的次数， 也可以减少在扩增过程中引起的突变错配， 从而减少无效克隆。由于EB染色会对DNA分子造成一定的损伤［4］， 所以再回收PCR产物的过程中， 使用上海华舜胶回收试剂盒中提供的LightBlue 染液。

　　电转化是一种利用瞬间高压， 在细胞膜上击出可以通过大分子物质的孔， 从而将所需物质转入细胞内的一种转化方法。它是目前常用的转化方法中转化率最高的方法， 所以本研究选用电转化法进行抗体库的建立［5］。最近的研究表明， 电转过程中较小的质粒比大的质粒容易进入细菌， 超螺旋的DNA较环状、 单切口环状及线状DNA更易进入细菌， 所以T4 DNA连接酶与DNA结合而形成的大分子复合物以及随后的超螺旋DNA解旋成为单切口环状很可能是T4 DNA连接酶导致电转化效率降低的主要原因。因此本研究在实验过程中采用了70℃热灭活T4 DNA连接酶， 然后用乙醇沉淀连接产物， 去除连接体系中的离子， 这样可以减少T4连接酶对电转化的影响， 保证得到最高的转化效率。

　　建成后的抗体库经过酶切鉴定， 所得到的片段大部分为正确克隆， 说明本实验成功建立了一个总库容量达到5.15×1011的抗体库［6］， 为今后进一步的筛选工作奠定了实验基础。

参考文献

［1］ Khler G ， Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity［J］. Nature， 1975， 256(5517): 495-497.

［2］ Tanha J， Dubuc G， Hirama T， et al. Selection by phage display of llama conventional V(H) fragments with heavy chain antibody V(H)H properties［J］. J Immunol Methods， 2002， 263(1-2): 97-109.

［3］ 董志伟， 王 琰. 抗体工程［M］. 2版. 北京: 北京医科大学出版社， 2002: 107-130.

［4］ 萨姆布鲁克J， 拉塞尔DW(黄培堂， 等译). 分子克隆实验指南［M］. 3版. 北京: 科学出版社， 2002: 26-63.

［5］ 韦晓明， 苏明权， 杨安钢， 等. 电转化条件对大肠杆菌XL1Blue菌株转化效率的影响［J］. 生物技术通讯， 2003， 14(6): 566-569.

［6］ 谢小芳 ， 申咏梅， 杨晓春， 等. Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(2): 160-167.