小鼠几丁质酶的重组表达和抗体制备

【摘要】 目的: 检测脂多糖（LPS）刺激成骨细胞后， 几丁质酶（chitotriosidase）基因表达变化情况。进行小鼠chitotriosidase的原核和真核表达， 并利用原核表达纯化的蛋白， 制备兔抗鼠多克隆抗体。方法: 用LPS刺激MC3T3E1细胞， 提取mRNA， 通过RTPCR获得小鼠chitotriosidase的编码区全长序列， 克隆进pRSET A载体， 转化BL21菌株， IPTG诱导表达。获得的包涵体蛋白用镍柱纯化后， 作为抗原免疫兔子， 制备多克隆抗体。用该抗体检测真核表达的小鼠chitotriosidase蛋白， 并确定抗体的灵敏度和特异性。结果: LPS明显刺激chitotriosidase表达。原核表达的包涵体蛋白经镍柱纯化后也能制备出效果较好的多克隆抗体。结论: 成功地克隆表达了小鼠的chitotriosidase蛋白， 并制备出高灵敏度、 高特异性的多克隆抗体， 为进一步阐明chitotriosidase在病理条件下的表达变化和功能提供了一条途径。

【关键词】 几丁质酶; 脂多糖; 重组表达; 多克隆抗体

　　几丁质酶（chitotriosidase）是一类特异性水解几丁质的蛋白。虽然在哺乳动物体内还没有发现几丁质， 研究人员已经在人、 大鼠等物种中克隆得到了chitotriosidase及几个相关家族成员， 它们都属于糖水解酶18家族。大量文献报导， chitotriosidase在很多与炎症反应相关的疾病患者体内表达升高。在体外试验中也已证明， IFNγ和TNFα等炎症性细胞因子能够诱导chitotriosidase表达［1， 2］。但是， 该基因的功能目前尚不清楚。我们用脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激成骨细胞株MC3T3E1， 发现chitotriosidase表达升高。我们从LPS刺激的细胞中提取RNA， 通过RTPCR得到该基因的全长编码序列， 并进行了该蛋白的原核和真核表达。以原核表达纯化的蛋白为抗原， 制备抗体， 为今后研究该基因的表达调控机制和生物学功能打下了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌BL21为本实验室保存， 质粒pRSET A和 pcDNA3.1D 为Invitrogen公司产品。新西兰大白兔(雄性， 质量250 kg)购自广州中医药大学实验动物中心; 各种限制性内切酶、 dNTP、 Taq DNA聚合酶和Pfu聚合酶购自TaKaRa公司; 转染试剂Lipofectamine 2000， TRIzol和逆转录试剂盒购自Invitrogen公司; 镍柱， LPS， 完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂购自Sigma公司; DMEM为Gibco公司产品; 胎牛血清购自杭州四季青公司; 抗Histag抗体购自Merck公司; HRP偶联的羊抗兔二抗， 增强化学发光(ECL)检测试剂盒为KPL公司产品。蛋白定量试剂盒购自Biorad公司。引物合成和测序由上海英骏生物技术有限公司完成。小鼠来源的成骨细胞株MC3T3E1购自中国医学科学院细胞中心， cos7细胞为本试验室保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养和LPS刺激细胞方法 MC3T3E1细胞培养在DMEM（含100 mL/L FBS）， 置于37℃、 50 mL/L CO2温箱中。待细胞达到90%汇合时， 接种6孔板。过夜后， 加入LPS至终浓度为10 mg/L。检测chitotriosidase的表达变化的引物序列: 上游引物: 5′GACCCTGTTAGCCGTTGG3′， 下游引物: 5′CTTGGAGTCTCGGATGGA3′。PCR产物经测序证明序列正确。

　　1.2.2 小鼠chitotriosidase编码区全长序列的获得和真核与原核表达质粒的构建 LPS刺激细胞6 h后， 弃去培养液， 直接加入1 mL TRIzol。然后按照说明书提取总RNA， 反转录得到cDNA。用PCR的方法获得chitotriosidase编码区的全长序列（不含信号肽）， 在引物的末端分别加入Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点。引物序列为: 上游引物5′GATCTCGAGGCAAAACTGGTCTGCTACCTC3′， 下游引物5′CTAGAATTCGCTCCAGGTACAACATTTGC3′; 克隆到pRSET A载体， 命名为chpRSET。另外设计一对引物， 在末端分别加入Xba Ⅰ和Not Ⅰ的酶切位点。引物序列为: 上游引物5′ATGCGGCCGCATGGTGCAGTCCCTGGCCT3′， 下游引物5′CTATCTAGAGCTCCAGGTACAACATTTGC3′， 克隆到pcDNA3.1D载体， 命名为chpcDNA。以上两个载体经测序证明序列正确。

　　1.2.3 融合蛋白的表达、 纯化和定量 把表达载体chpRSET转化大肠杆菌BL21菌株， 经1 mmol/L IPTG诱导5 h， 超声波裂解细胞， 离心收集包涵体。用8 mol/L尿素溶解包涵体。最后用镍柱纯化蛋白。Biorad试剂盒测定蛋白浓度， 作为抗原免疫兔子。

　　1.2.4 抗体制备和鉴定 1 mL抗原(根据蛋白定量的结果约含抗原量300 μg)与等体积完全弗氏佐剂(CFA)充分混合， 在白兔背部进行皮下注射。2周后， 等量抗原和不完全弗氏佐剂混匀， 同样方法注射。以后每2周加强免疫1次。一共加强免疫3次。最后心脏取血制备抗血清。采用间接ELISA法检测产生抗体的效价。

　　1.2.5 在真核细胞中瞬时表达 将chpcDNA3.1D质粒转染cos7细胞， 以空载体为对照。具体步骤为如下: cos7细胞接种10 cm培养板， 使其24 h后生长达到80%汇合。将20 μL Lipofectamine 2000和10 μg质粒DNA分别与1 mL无血清培养基混合， 室温静置5 min。然后将两者混合， 室温静置20 min， 逐滴加入培养板。培养48 h时收集细胞和上清进行重组蛋白表达检测。

　　1.2.6 Western blot检测 真核细胞转染后的培养液上清和细胞裂解液各取20 μL进行Western blot检测。同时用自己制备的多克隆抗体和抗Histag的抗体检测重组表达蛋白是否表达并检测多克隆抗体的灵敏度和特异性。蛋白样品进行120 g/L的SDSPAGE电泳， 在69 V恒压下1.5 h转移到PVDF膜上， 5 0 g/L 脱脂奶粉室温封闭2 h， TBST洗膜3次， 每次10 min， 加入以TBS稀释的自己制备一抗和抗Histag的抗体（1∶1 000）， 室温结合2 h， TBST洗膜3次， 每次10 min。以TBS稀释HRP标记的羊抗兔二抗（1∶2 000）， 室温孵育1 h， TBST洗膜4次， 每次10 min， ECL法显色鉴定， X胶片记录结果。

　　2 结果

　　2.1 LPS刺激细胞诱导chitotriosidase表达 LPS刺激MC3T3E1细胞， 在指定的时间收集RNA， 做RTPCR比较chitotriosidase表达变化情况。发现LPS刺激6 h后， 基因表达明显升高（图1）。

　　2.2 表达载体的构建 将编码区全长序列通过RTPCR方法得到。将用于原核表达的PCR产物和pRSET A载体用EcoR I和Xho I酶切后连接; 将用于真核表达的PCR产物和pcDNA3.1D用Xba I和Not I酶切后连接。两个表达载体经测序确定， 目的片段已正确插入。

　　2.3 Chitotriosidase在大肠杆菌中的表达、 纯化和定量 200 mL菌液经IPTG诱导后， 在相对分子质量（Mr）约42 000处获得大量的重组蛋白(图2) ， 经超声波裂解细胞， 离心后分别取上清和沉淀跑SDSPAGE电泳。发现该蛋白绝大部分位于包涵体中(图3)。包涵体用8 mol/L尿素溶解后用镍柱纯化。通过蛋白定量， 确定浓度约为0.3 g/L， 每次免疫家兔所用蛋白抗原量约为0.3 mg。

　　2.4 多克隆抗体鉴定 取抗血清， 用间接ELISA测定抗体的效价。结果显示， 抗血清中抗体效价的滴度达1∶13 000以上。以1∶1 000稀释的抗血清和抗Histag的抗体为一抗， 用Western blot检测真核表达上清中的蛋白。抗血清与抗Histag的抗体在同一位置检测到单一的条带。这说明， 用镍柱纯化得到的未复性蛋白可以直接作为抗原免疫兔子， 得到灵敏度和特异性较好的抗体(图4)。另外， 培养液上清中的蛋白含量远大于细胞裂解液中的含量(图5)。根据文献报道人的chitotriosidase是一个分泌蛋白［3］。我们的Western blot结果在小鼠中验证了这一结论。

　　3 讨论

　　Chitotriosidase是哺乳动物chitotriosidase家族成员。近年来研究人员陆续发现了该家族的多个成员， 包括chitotriosidase， 酸性chitotriosidase， YKL40等。研究表明哺乳动物chitotriosidase家族基因可能是机体应对不利环境的一种应激反应， 对细胞和组织起保护作用［4， 5］。尤其是chitotriosidase和YKL40往往参与到组织重构和再生相关的病理过程中。例如， 动脉粥样硬化， 肝纤维化， 肺纤维化和肉状瘤病等患者的血清中， chitotriosidase浓度和活性都有明显升高［6， 7］。值得注意的是， 这些病理过程都伴随着炎症反应的发生。另外， 体外实验也证明， 细胞因子能够诱导巨噬细胞表达chitotriosidase。因此， 现在普遍认为炎症因子是刺激chitotriosidase表达的一个重要诱因。

　　我们的试验证明， LPS刺激成骨细胞后能够引起chitotriosidase表达升高。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的重要成分， 也是细菌感染后引起炎症反应的重要因子。我们的结果暗示在骨组织感染或者炎症条件下， chitotriosidase的表达可能会升高。目前对于该基因在生理和病理过程中的作用尚不清楚。我们推测它可能在骨髓炎， 骨关节炎等骨组织炎症性疾病中起保护作用， 相关研究工作正在进行中。

　　以小鼠为模型研究基因功能有很多优势。小鼠作为哺乳动物， 很多基因的功能与人有相同或相似之处; 可以在小鼠体内做很多无法在人身体上进行的试验。因此， 我们制备的抗小鼠chitotriosidase抗体， 为将来在动物模型中研究chitotriosidase的表达情况和生物学功能提供了有利的工具， 也有助于进一步了解骨髓炎等骨科炎症性疾病的病理过程。

参考文献

［1］ Malaguarnera L， Musumeci M， Licata F， et al. Prolactin induces chitotriosidase gene expression in human monocytederived macrophages［J］. Immunol Lett， 2004， 94(25): 57-63.

［2］ Di Rosa M， Musumeci M， Scuto A， et al. Effect of interferongamma， interleukin10， lipopolysaccharide and tumor necrosis factoralpha on chitotriosidase synthesis in human macrophages［J］. Clin Chem Lab Med， 2005， 43(17): 499-502.

［3］ Renkema GH， Boot RG， Au FL， et al. Chitotriosidase， a chitinase， and the 39 kDa human cartilage glycoprotein， a chitinbinding lectin， are homologues of family 18 glycosyl hydrolases secreted by human macrophages［J］. Eur J Biochem， 1998， 251(2): 504-509.

［4］ Hakala BE， White C， Recklies AD. Human cartilage gp39， a major secretory product of articular chondrocytes and synovial lining cells， is a mammalian member of a chitinase protein family［J］. J Biol Chem， 1993， 268(34): 25803-25810.

［5］ Jacques C， Recklies AD， Levy A， et al. HCgp39 contributes to chondrocyte differentiation by inducing SOX9 and type II collagen ex2p ressions［J］. Osteoarthritis Cartilage， 2007， 15(2): 138-146.

［6］ Bargagli E， Margollicci M， Perrone A， et al. Chitotriosidase analysis in bronchoalveolar lavage of patients with sarcoidosis［J］. Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis， 2007， 24 (1): 59-64.

［7］ Kucur M， Isman FK， Balci C， et al. Serum YKL40 levels and chitotriosidase activity as potential biomarkers in primary prostate cancer and benign prostatic hyperplasia［J］. Urol Oncol， 2008， 26(1): 47-52.