T617细胞培养上清中肿瘤蛋白P185的表达

　　　　作者：王弦， 谢小强， 曹亮， 徐振山， 宋礼华

【摘要】 目的: 从转染Her2/neu基因的T617细胞上清中纯化p185蛋白， 研究其免疫原性和探究其在血清学诊断中应用的可能性。方法: 采用溴化氰活化的Sepharose 4B为基质， 通过交联A18 mAb， 用亲和层析的技术纯化p185 蛋白。将收集的T617细胞上清循环过亲和层析柱， 经梯度盐溶液解离与抗体结合的p185 蛋白， 收集到蛋白洗脱峰， 浓缩后用ELISA检测p185的免疫反应性， 并经SDSPAGE和Western blot 进一步鉴定。结果: ELISA检测p185保持了良好的与抗体反应活性， SDSPAGE和Western blot进一步证实纯化蛋白的相对分子质量(Mr)约为185 000， 是HER2/neu编码的肿瘤抗原。结论: 从转基因细胞上清中成功获取p185肿瘤抗原， 可进一步用于乳腺癌的实验室诊断研究。

【关键词】 HER2/neu; 单克隆抗体; 肿瘤蛋白; 免疫亲和层析

　　HER2/neu基因， 又名cerbB2， 定位于人染色体17q21， 编码相对分子质量(Mr)约为185 000的跨膜糖蛋白(p185)， p185包含1225个氨基酸残基， 由信号肽、 胞外区、 跨膜区及胞内区4个部分组成， 在乳腺、 卵巢、 肺、 胃、 前列腺等10余种癌症中均显示部分患者有过量表达， 作为一个重要的肿瘤表面标记蛋白， 尤其对乳腺癌， 已被国际公认是重要的临床指标。目前国内外已有上市的免疫组化试剂盒和药物用于检测和靶向治疗乳腺癌， 为了进一步探索诊断乳腺癌新方法和建立相关的诊断标准， 我们利用亲和层析方法从T617细胞上清中提取和纯化了细胞所分泌的肿瘤蛋白p185， 初步解决了用基因工程方法较难表达p185的问题， 为下一阶段实验奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 T617细胞株为转染Her2/neu基因的NIH/3T3细胞株， 其膜表面高表达p185; A18细胞株和A21细胞株为稳定分泌抗p185蛋白的单克隆抗体（mAb）杂交瘤细胞， mAb亚类均为IgG1［1］。上述细胞株均由中国科学技术大学生命科学院刘兢教授惠赠。雌性BALB/c小鼠， 由安徽安科公司提供， 用于制备mAb腹水。DMEM购自Gibco公司; 小牛血清购自杭州四季青公司; 溴化氰活化的Sepharose 4B购自Sigma公司; Model 550型酶标仪购自Bio Rad公司; UV1型紫外检测仪购自Pharmacia公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 A18， A21杂交瘤腹水的制备和纯化 无菌培养收集A18和A21细胞［2］， 分别以5×106个细胞接种注射降植烷的BALB/c小鼠腹腔， 10 d后可获富含抗体的腹水， 收集腹水， 得A18 腹水11.5 mL， A21腹水30 mL。按照IgG1抗体纯化方法: 辛酸－硫酸铵盐析法进行纯化。经离心、 稀释后， 加辛酸除去非IgG蛋白后， 经50%饱和硫酸铵沉淀， 透析后获粗制抗体。经紫外测得A18蛋白含量约为9.6 g/L， A21蛋白含量约为16 g/L。

　　1.2.2 A18酶结合物的制备 取0.5 mL HRP溶液（5.0 mg HRP溶于0.5 mL h3O中）加0.5 mL过碘酸钠溶液（6.4 mg过碘酸钠溶于0.5 mL h3O中）， 4℃搅拌30 min; 加0.5 mL乙二醇溶液（4.5 μL乙二醇溶于0.5 mL h3O中）， 室温30 min; 加1 mL A18（5 g/L）对2 L碳酸钠缓冲液（3.18 g碳酸钠， 5.88 g碳酸氢钠溶于2 L h3O中， pH9.5）4℃透析过夜; 取透析液2 mL加0.17 mL硼氢化钠溶液（5 mg硼氢化钠溶于1 mL h3O中）4℃搅拌2 h; 滴加2.2 mL饱和硫铵溶液， 4℃搅拌， 0.5 h后静置3 h; 12 000 r/min， 离心10 min， 沉淀以2.0 mL PBS悬浮， 对2.5 L PBS透析过夜。棋盘滴定测其工作浓度。

　　1.2.3 亲和层析柱的制备 按CNBractivated Sepharose 4B说明书中的方法， 制备2 mL 湿胶（1 g干粉可获得3.5 mL湿胶）， 每mL湿胶交联15 mg A18， 4℃过夜。以 Lowry法检测偶联前后偶联液中A18的浓度， 并计算mAb的结合率。

　　1.2.4 T617细胞上清的收集、 亲和层析纯化和浓缩 将收集的T617细胞上清约1 L过亲和层析柱， 流出液循环上样， 4℃过夜。先用PBST洗去未结合的蛋白， 再以PBS平衡， 洗脱液（0.2 mol/L HAC ph3.5）洗脱。收集洗脱峰组分， 对PBS透析， PEG20000 浓缩后用lowery法测定洗脱峰蛋白的浓度。

　　1.2.5 p185蛋白的鉴定 将亲和柱层析后的洗脱峰浓缩样样品30 μL进行SDSPAGE电泳明确抗原的纯度、 Mr大小， 再以Western blot法进一步确证该纯化抗原系A18 mAb识别的抗原。双抗夹心ELISA法: 用A21包被酶标板（10 mg/L）， 4℃过夜; 10 g/L BSA封闭， 4℃过夜; 加亲和柱层析后的洗脱峰浓缩样样品（PBST稀释至10 μg/L）， 以PBS作阴性对照， 37℃ 1 h; 加HRPA18， 37℃ 1 h; TMB显色适时终止测A值。2 结果

　　2.1 A18， A21杂交瘤腹水纯化前后SDSPAGE 结果见图1。

　　图1 A18， A21杂交瘤腹水和纯化后的腹水

　　1， 3: 纯化前腹水; 2: 纯化后A18; 4: 纯化后A21.

　　2.2 亲和层析纯化抗原 在15 mg mAb/mL湿胶条件下， 测得mAb的结合率为 92.66%。将收集的T617细胞上清于4℃下反复上样3次， 以PBS洗柱至A280到基线， 再以0.2 mol/L HAC（pH 2.5）洗脱（A280监测， 灵敏度0.1A， 纸速2 mm/min）得到1个高尖而小的洗脱峰。共收集洗脱液约16 mL， 浓缩后测定洗脱峰收集液中蛋白的浓度约为0. 2 g/L。

　　2.3 P185蛋白的鉴定 SDSPAGE、 Western blot法: 亲和层析洗脱峰浓缩样非还原 SDSPAGE及Western blot结果见图2。可见泳道上相对应的位置出现了1条带， 与marker相比较， Mr约为185 000。免疫印迹显示该抗原与A18呈阳性显色反应， 进一步确证经亲和层析纯化的该蛋白是A18所识别的特异性抗原。双抗夹心ELISA法: 结果显示A值为0.42， 大于阴性对照（0.16）2.1倍， 表明亲和柱层析后的洗脱峰浓缩样样品中系纯化的p185蛋白， 具有良好的免疫反应活性。

　　图2 A18识别抗原纯化后的电泳及Western blot分析

　　1: A18识别抗原纯化浓缩后Western blot; 2: A18识别抗原纯化浓缩后非还原 SDSPAGE; M: 蛋白marker.

3 讨论

　　肿瘤抗原的存在与发现是肿瘤免疫诊断和治疗的基础， 肿瘤抗原的鉴定在肿瘤诊断和治疗的发展中扮演着重要角色， 特别是肿瘤抗原的纯化对于mAb在血清学诊断中的应用具有重要意义。所以寻找肿瘤抗原是目前肿瘤免疫研究的主要目标之一。尽管20世纪90年代以来涌现出了CTL筛选法、 多肽洗脱法、 SELDI蛋白质芯片等多种新的肿瘤抗原筛选方法， 但利用mAb免疫亲和层析纯化抗原仍不失为肿瘤抗原纯化鉴定的一种好方法。

　　抗原和抗体的作用具有高度的专一性， 并且它们的结合亲和力极强。因此用适当的方法将抗原或抗体结合到层析剂上， 便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质， 根据此种特性而设计出来的一种生物分离分析方法就是免疫亲和层析。免疫亲和层析操作简单、 迅速， 分离效率高， 尤其适合分离样品中含量极少又不稳定的活性物质。同时， 亲和层析的过程也是高度浓缩的过程， 它可以从样品中去除大量的杂质， 产率较高的得到少量的物质。但使用该方法的前提是先要获得针对抗原的具有较好特异性的mAb， 其次要选择合适的蛋白洗脱条件。抗原的洗脱， 通常用pH值为2.0～2.2的酸性缓冲溶液， 抗原的最佳洗脱条件必须使失活量达到最小， 为了保持抗原蛋白的天然构象， 收集的洗脱液应立即用碱性溶液中和［3］， 实验中我们是在收集洗脱峰组分的管中预装pH9.0 NaOH中和。

　　本研究中以纯化后的A18偶联CNBractivated Sepharose 4B凝胶， 经多次实验确定使用低pH值的洗脱液解离与抗体结合的抗原， 在收集时加入高pH值的碱溶液中和， 最终从细胞上清中纯化出了相关抗原。经SDSPAGE、 Western blot和双抗夹心ELISA法鉴定表明， 所纯化出的肿瘤相关抗原保持了良好的与抗体反应活性， 并鉴定出其Mr约为185 000， 下一步我们将对其进行2D电泳及肽指纹图谱分析， 以获得该抗原的氨基酸序列， 进而得到该抗原的基因序列［4］， 还可以此纯化后的抗原免疫动物制备抗体， 应用蛋白质芯片技术平台检测患者血液体液中该种蛋白的含量， 以及作为诊断试剂中的阳性对照， 进一步探讨该乳腺癌相关抗原在乳腺癌实验室诊断中的临床应用价值。但是因其表达量较低， 因而纯化工作的收获率较低。只有进行大规模的制备才能得到用于研究和市场用量的纯化蛋白产品。

参考文献

［1］ 王 琛， 李 昀， 李 平， 等. 表面表位包埋法制备肿瘤表面抗原P185neu/cerbB2单克隆抗体及其性质研究［J］. 中国免疫学杂志， 2000， 16(10): 539-541.

［2］ 朱立平， 陈学清， 张建中. 免疫学常用实验方法［M］. 北京: 人民军医出版社， 2003: 342-357.

［3］ Yu XL， Jiang JL， Li L， et al. The glycosylation characteristic of hepatomaassociated antigen HAb18G/CD147 in human hepatoma cells［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2006， 38(11): 1939-1945.

［4］ 柳晓燕， 姚晓玲， 宋 玉， 等. 结肠癌相关抗原的制备及其临床意义［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(4): 335-337.