血清IL12p40和IL18在缓解复发型多发性硬化中的作用及相关分析

【摘要】 目的: 探讨白细胞介素IL12p40、 IL18及干扰素γ（IFNγ）在缓解复发型多发性硬化（RRMS）发病中的作用。方法: 选取RRMS急性期患者24例， 对照组为非炎性神经系统疾病(NIND)患者12例， 应用ELISA法测定受试者血清中IL12p40、 IL18及IFNγ水平。结果: 与NIND组相比， RRMS组血清中IL18水平明显升高， 而IL12p40明显下降（P&<0.05）。血清IFNγ水平在两组间无明显差异， 而与IL18水平之间呈显著正相关。结论: IL18与IL12p40均参与了多发性硬化发病的免疫病机。

【关键词】 缓解复发型多发性硬化; 血清; IL12p40; IL18

　　多发性硬化(multiple sclerosis， MS)是一种中枢神经系统炎性脱髓鞘自身免疫性疾病， Th1型免疫反应及IFNγ的合成是MS的主要特征， 由Th1型细胞和单核细胞产生的IFNγ、 IL12、 IL18等前炎症因子在其发病机制中起关键作用［1］， 而IL18与IL12在刺激Th1细胞、 NK细胞增殖， 增强NK细胞的细胞毒作用， 诱导免疫效应细胞产生IFNγ等方面， 具有协同作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 检测IL12p40的ELISA试剂盒购自美国R＆D 公司， IL18 ELISA试剂盒购自德国Bender 公司， IFNγ ELISA试剂盒购自深圳晶美公司。RRMS组24例， NIND组12例， 均排除其他自身免疫性疾病、 其他部位近期感染、 肿瘤等， 并于检测前3个月内未用过皮质激素与免疫抑制剂。RRMS组均符合2001年McDonald诊断标准(病程超过1年， 发作2次或2次以上， 有2个或2个以上部位病变的客观临床依据)， 均具有复发缓解的疾病过程， 于急性恶化(新症状出现或原有症状的明显加重， 至少症状持续24 h以上)1周内接受治疗， 排除其他中枢神经系统多发性病变的诊断。NIND组为对照组， 均为非炎性神经系统疾患， 脑脊液生化， 常规检测正常。受试者血清样本均在入院当日或次晨于治疗前留取， 并分管封存于-70℃冰箱待测。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血清中IL12p40、 IL18和IFNγ水平的ELISA检测 血清中IL12p40、 IL18和IFNγ水平的检测采用双抗体夹心ELISA法， 其中IL12p40与IFNγ的检测原样加样， 而IL18水平的检测需1∶2稀释， 并严格遵循试剂盒说明书检测。

　　1.2.2 IL18及IL12p40的检测 (1)抗IL18 （或IL12p40）mAb已预先包被于酶标板上。(2)在每一孔中加入相应的标准品、 样本和对照， 孵育。(3)洗板后在所有孔中加入生物素化的抗IL18mAb， 在200 r/min微板振荡器上孵育， 洗板， 加辣根过氧化物酶标记的亲和素入所有孔， 以上述方式孵育。IL12p40的检测于此步骤与IL18不同， 在洗板后加入的是辣根过氧化物酶标记的鼠抗IL12p40多克隆抗体。(4)洗板后在所有孔中加入相应的显色剂， 避光孵育。(5)加入终止液， 在450 nm波长处读取A值。

　　1.2.3 统计学分析 实验数据用x±s表示， 组间采用PEMS3.1软件行两样本均数比较的t检验， 并对IL12p40和IL18进行相关性分析。

　　2 结果

　　ELISA检测结果显示， 与NIND组相比， RRMS组血清中IL12p40水平明显下降（P&<0.05）， IL18水平明显升高（P&<0.05）， 而IFNγ水平在NIND和RRMS两组对比中无统计学意义（P&>0.05， 表1） 。

　　RRMS组血清中IL12p40与IL18水平呈显著负相关(r=-0.89， P&<0.01)， 血清中IL18与IFNγ水平呈显著正相关(r=0.89， P&<0.01)。表1 NIND与RRMS组血清中IL18、 IL12p40及IFNγ的水平

　　3 讨论

　　IL12是由P40和P35这2个亚基组成的异二聚体的细胞因子P70， 具有生物活性的IL12p70是介导MS始发阶段免疫反应的重要因子， 可正向调节Th1型免疫反应使病情加重， 同时可抑制Th3型细胞的增殖， 在MS发作期后的缓解期和继发进展期起关键作用。IL12p40可通过与IL12p70竞争高亲和力的IL12受体而拮抗IL12p70的效应［2］， 因此， P40基因启动子的活性及其调节机制对于IL12表达的调节更有重要意义。已有研究表明， 相比于活动期MS， 稳定期MS者IL12p40的表达升高［3］， 且未治疗过的MS者其外周血单核细胞产生IL12p40重链的量明显减少， IL12p40mRNA的表达及IL12p40蛋白水平也减少［4］， 而于治疗后IL12p40血清水平升高［5］。在本研究中， RRMS组血清中IL12p40水平明显减少， 而此时的RRMS患者正处于临床活动期， 因此有理由认为在RRMS的活动期， IL12p40水平的下调， 使IL12p70的生物学活性增强， 通过促进Th1型免疫反应， 发挥其在RRMS中的重要的免疫病理损伤机制， 治疗后随着IL12p40水平的增高， IL12 p70水平的下调， RRMS进入稳定期。本研究还发现， 随着IL12p40水平的降低， 同时伴随着IL18水平的明显升高， 且IL12p40与IL18水平呈显著负相关， 表明了Th1表型的IL18在RRMS的急性期具有的重要的促发作用， 与IL12p40在其中的作用相反， 两者之间具负相关性， 进一步的关联有待更深入的研究。因此在MS的发病机制中， 免疫系统的激活参与其中， IL12p40与 IL18的作用尤为重要， Th1和Th3两种类型的细胞因子相互之间的作用与MS的发展和缓解密切相关， 而IL12在其中作用关键， 被证明可能是为数不多的可始发并使MS的免疫反应持续存在的细胞因子之一［6］。

　　在MS的免疫病理损伤机制中， IFNγ的合成作用重要， 虽然在我们的研究中， RRMS组血清中IFNγ水平无明显升高， 这不同于以往的研究， 但可见其与IL18水平之间呈显著正相关， 故不能否认IFNγ在MS发病机制中调节CK的“级联作用模式”及具有的增强免疫应答的作用， 方法学上的障碍、 小样本的数据分析、 细胞因子短的半衰期及细胞因子被检测时不同的疾病阶段均有可能导致此因子检测结果阴性。

参考文献

［1］ Matejuk A， Dwyer J， Ito A， et al. Effects of cytokine deficiency on chemokine expression in CNS of mice with EAE［J］. J Neurosci Res， 2002， 67(5): 680-688.

［2］ Mattner F， Fischer S， Guckes S. The interleukin12 Subunit P40 specifically inhibits effects of the interleukin12 heterodimer［J］. Eur J Immunol， 1993， 23（9）: 2202-2208.

［3］ Ferrante P， Fusi ML， Saresella M. Cytokine production and surface maker expression in acute and stable multiple sclerosis: altered　IL12 production and augmented signaling lymphocytic activation molecule (SLAM)expressing lymphocytes in acute multiple sclerosis［J］. J Immunol， 1998， 160（3）: 1514-1521.

［4］ Rohowskykochan C， Molinaro D， Choudhry A. Impaired interleukin12 Production in multiple sclerosis［J］. Mult Sclera， 1999， 5（5）: 327-334.

［5］ Dirk Bahner， Christine klucke， Bernd kitze.Interferonbeta1b increases serum interleukin12p40 levels in primary Progressive multiple sclerosis patients［J］. Neuroscience Letters， 2002， 326（2）: 125-128.

［6］ Van BoxelDezaire AH， Hoff SC， Van osten BW. Decreased interleukin10 and increased interleukin12p40 mRNA and associated with disease activity and characterize different disease stages in multiple sclerosis［J］. Ann Neurol， 1999， 45（6）: 695-703.