他克莫司与环孢菌素A对肝移植受者CD4/CD8 T淋巴细胞亚群及共刺激分子的调节作用

　　　　作者：白杨娟， 王兰兰， 蔡 蓓， 邹远高， 冯伟华， 严律南

【摘要】 目的: 探讨他克莫司（Tacrolimus， FK506）与环孢菌素A（CsA）对肝移植受者T淋巴细胞亚群共刺激分子的调节作用。方法: 采用荧光标记单克隆抗体(mAb)结合流式细胞技术， 测定移植术后使用FK506或CsA治疗2月末的肝移植受者外周血T细胞亚群及其表面共刺激分子CD28、 CD152 和ICOS的表达情况。以健康志愿者（健康对照组）和患终末期肝脏疾病拟进行肝移植者（疾病对照组）为对照。结果: 疾病对照组T细胞亚群平衡紊乱、 共刺激分子表达异常（P&<0.05）。治疗组肝移植受者T淋巴细胞亚群表达恢复至健康对照水平， T细胞表面CD28和ICOS分子表达显著降低（P&<0.05）而CD152分子表达明显升高（P&<0.05）。比较不同药物治疗组: CsA治疗组CD4+T细胞表达和CD8+T细胞表面CD28、 CD152分子表达均明显高于FK506治疗组（P&<0.05）; 其他指标无统计学意义（P&>0.05）。结论: 在常规血药浓度条件下FK506和CsA的对CD4/CD8T细胞亚群及共刺激分子的免疫调节作用存在差异。FK506对T细胞亚群的调节作用强于CsA。FK506可同时抑制正性共刺激分子CD28和ICOS表达并促进负性共刺激分子CD152表达， 而CsA对T细胞免疫抑制作用主要是通过促进CD152分子的高表达介导。

【关键词】 他克莫司; 环孢菌素A; CD28; CD152; ICOS; 肝移植

　　他克莫司（Tacrolimus， FK506）与环孢菌素A（Cyclosporine A， CsA）是目前国内外器官移植术后临床应用最为普遍的免疫抑制剂。它们同属钙调磷酸酶抑制剂（Calcineurine inhibitor， CNI）类药物， 主要通过抑制T细胞活化相关细胞因子基因的转录激活及相应细胞因子的表达发挥免疫抑制作用。T细胞活化相关细胞因子的表达作为免疫细胞信号传导的末期事件必然受到上游信号的影响， 而共刺激信号分子在T细胞活化和功能效应调节中扮演了重要角色， T细胞发生免疫活化或免疫耐受直接受这些信号分子的调控。尽管FK506与CsA同属钙调磷酸酶抑制剂类药物， 但他们在免疫调节效应、 用药剂量和毒性作用等方面却具有各自的特点。因此， 我们拟通过分析FK506和CsA对肝移植术后患者外周血T细胞亚群及其各亚群细胞表面共刺激分子CD28、 CD152（CTLA4）和ICOS的调节作用， 探讨FK506与CsA对CD4/CD8T淋巴细胞亚群共刺激分子表达的影响。

1 对象和方法

　　1.1 研究对象 (1)接受CNI治疗的肝移植受者（肝移植受者组）， 为2004-07/2004-12在四川大学华西医院肝移植中心接受同种异体肝移植的受者， 30例， 男性， 28～62岁， 其中20例接受FK506抗排斥方案治疗（FK506+激素+硫唑嘌啉或骁悉）， 10例接受CsA抗排斥方案治疗（CsA+激素+硫唑嘌啉或骁悉）。根据使用的CNI不同， 进一步分为FK506治疗组和CsA治疗组。于肝移植术后接受免疫抑制治疗2月末采集外周血标本进行各指标测定。(2)终末期肝脏疾病患者（疾病对照组）， 为拟接受肝移植的终末期肝脏疾病患者， 20例， 男性， 年龄29～60岁， 其中肝癌13例， 肝硬化4例， 重症肝炎3例。所有患者均未使用FK506、 CsA或其他相关免疫调节药物。(3)健康对照: 均为健康志愿者， 20例， 男性， 20～50岁， 无相关疾病史， 均未使用过FK506、 CsA或其他相关免疫调节药物。

　　1.2 方法

　　1.2.1 标本采集和处理 采集EDTA抗凝外周全血标本。留取部分全血用于FK506和CsA血药浓度检测后， 剩余标本于采集后2 h内以Ficoll淋巴细胞分离液制备单个核细胞后标记检测。

　　1.2.2 FK506血药谷浓度测定 在ABBOTT IMX（ABBOTT公司， 美国）分析仪上使用TacrolimusⅡ试剂盒（ABBOTT公司， 美国）以荧光偏振免疫原理测定FK506血药谷浓度。

　　1.2.3 CsA血药谷浓度测定 应用高效液相色谱法（HPLC）测定CsA血药谷浓度。

　　1.2.4 T细胞亚群和共刺激分子表达测定 相应荧光标记单克隆抗体(mAb)20 μL与单个核细胞悬液或全血100 μL进行30 min避光标记反应， 溶血后使用EPICSXL型流式细胞仪（BECKMAN COULTER公司， 美国）测定各项指标。所用的荧光标记mAb为: CD4FITC/CD8PE/CD3PECY5、 CD4PE、 CD8PE、 CD28FITC、 CD154FITC、 CD4FITC、 CD8FITC、 ICOSPE鼠抗人mAb（Immunotech公司， 法国）; IgG1FITC、 IgG1PE、 IgG2PE鼠抗人的同型对照mAb（Immunotech公司， 法国）。分别测定T淋巴细胞表达率（CD3+ %）、 CD4+T淋巴细胞表达率（CD3+CD4+%）、 CD8+T淋巴细胞表达率（CD3+CD8+%）、 CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值 (CD4/CD8)、 CD4+CD28+细胞表达率（CD4+CD28+%）、 CD8+CD28+细胞表达率（CD8+CD28+%）、 CD4+CD152+细胞表达率（CD4+CD152+%）、 CD8+CD152+细胞表达率（CD8+CD152+%）、 CD4+ICOS+细胞表达率（CD4+ICOS+%）和CD8+ICOS+细胞表达率（CD8+ICOS+%）。

　　1.2.5 统计学分析 采用SPSS12.0软件对数据进行统计描述和统计分析， T细胞亚群结果以x±s表示， 组间比较采用t检验， 多组间比较采用方差分析; 共刺激分子的表达以中位数和四分位数间距表示， 样本间比较采用非参数秩和检验。

2 结果

　　2.1 肝移植受者FK506和CsA血药谷浓度 FK506治疗组受者FK506平均血药谷浓度（c0）为9.0±4.4 μg/L。CsA治疗组受者CsA平均血药谷浓度（c0）为185±55 μg/L。

　　2.2 肝移植受者组受者外周血T细胞亚群 疾病对照组患者外周血CD3+百分率接近健康对照水平（P&>0.05）， 但其CD4+CD3+百分率明显高于健康对照组（P&<0.05）而CD8+CD3+百分率明显低于健康对照组（P&<0.05）， CD4/CD8比值明显高于健康对照组（P&<0.05）。肝移植受者组外周血CD3+、 CD4+CD3+和CD8+CD3+百分率均恢复至健康对照水平。与疾病对照组比较， 肝移植受者组受者外周血CD3+百分率稍有回升， 其CD4+CD3+百分率明显降低而CD8+CD3+百分率明显回升（P&<0.05）， CD4/CD8比值明显降低（P&<0.05）。进一步分析不同药物治疗组T细胞亚群表达情况。FK506治疗组受者外周血T细胞亚群表达与健康对照组无统计学意义; 与疾病对照组比较， CD3+百分率水平接近、 CD4+CD3+百分率明显降低、 CD8+CD3+百分率明显升高、 CD4/CD8比值明显下降（P&<0.05）。CsA治疗组受者外周血T细胞亚群表达与健康对照组无统计学意义; 与疾病对照组比较， CD4+CD3+百分率稍有降低、 CD8+CD3+百分率稍有回升（P&>0.05）、 CD4/CD8比值明显降低（P&<0.05）。两治疗组比较， 虽然CD3+百分率无统计学意义， 但是CsA治疗组CD4+CD3+百分率显著高于FK506治疗组（P&<0.05）， 而同时其CD8+CD3+百分率则稍低于FK506治疗组， 两治疗组受者CD4/CD8比值无统计学意义（表1)。表1 肝移植受者外周血T细胞亚群分析

　　2.3 肝移植受者外周血T细胞表面共刺激分子表达分析

　　2.3.1 肝移植受者外周血T细胞表面CD28分子表达 疾病对照组外周血淋巴细胞表面CD28分子表达增加， CD4+CD28+和CD8+CD28+百分率显著高于健康对照组（P&<0.05）。肝移植受者外周血CD4+CD28+百分率明显低于疾病对照组（P&<0.05）并接近健康对照组水平， 而CD8+CD28+百分率则明显低于两对照组水平（P&<0.05）。进一步分析不同药物治疗组。FK506治疗组受者外周血CD4+CD28+和CD8+CD28+百分率均显著低于疾病对照组（P&<0.05）， 其中CD8+CD28+百分率还明显低于健康对照组（P＜0.05）。CsA治疗组受者外周血CD4+CD28+和CD8+CD28+百分率与疾病对照组比较均无统计学意义， 并稍高于健康对照组。两治疗组比较， CsA治疗组CD8+CD28+百分率明显高于FK506治疗组（P＜0.05， 表2)。表2 肝移植受者外周血T细胞表面共刺激分子表达分析

　　2.3.2 肝移植受者外周血T细胞表面CD152分子表达 疾病对照组患者外周血CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率均明显高于健康对照组（P＜0.05）。肝移植受者外周血CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率均显著高于健康对照组（P＜0.05）， 其中CD4+CD152+百分率还明显高于疾病对照组（P＜0.05）。进一步分析不同药物治疗组。FK506治疗组CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率均显著高于健康对照组（P＜0.05）， 与疾病对照组比较无统计学意义。CsA治疗组CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率显著高于健康对照组和疾病对照组（P＜0.05）， 同时也显著高于肝移植受者的总体水平（P＜0.05）。两治疗组比较， FK506治疗组CD8+CD152+百分率稍低于CsA治疗组， 而其CD4+CD152+百分率则明显低于CsA治疗组（P&<0.05， 表2)。

　　2.3.3 肝移植受者外周血T细胞表面ICOS分子表达 疾病对照组患者外周血CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率均显著低于健康对照组（P&<0.05）。肝移植受者外周血CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率均显著低于健康对照组（P&<0.05）， 与疾病对照组比较无统计学意义。进一步分析不同药物治疗组。FK506治疗组受者外周血CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率明显低于健康对照组水平（P&<0.05）， 与疾病对照组比较无统计学意义。CsA治疗组患者外周CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率明显低于健康对照组水平（P&<0.05）， 其中CD8+ICOS+百分率还明显低于疾病对照组（P&<0.05）。两治疗组间CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率无统计学意义（表2)。

　　3 讨论

　　已有研究证实， 钙调磷酸酶抑制剂FK506、 CsA主要的免疫抑制特性均为通过破坏T细胞TCR信号的传递， 从而抑制T细胞的特异性免疫反应［1-3］。对不同免疫抑制剂作用靶点的研究， 将会使我们进一步了解各种免疫抑制剂对T细胞活化和效应调节特点、 掌握它们对T细胞免疫耐的诱导调节效应， 从而更好地保证移植物的存活、 延长移植受者的生命。

　　在移植免疫反应中， CD4+T细胞与移植排斥反应密切相关。已有资料表明， CD4+Th1细胞主要参与急性排斥反应， 而CD4+Th3细胞则主要参与慢性排斥反应， 而CD8+T细胞在移植排斥反应中除具有攻击杀伤的细胞毒作用外， 同时还具有免疫调节效应。目前在免疫抑制剂的应用过程中， 移植后受者急性排斥反应发生率逐渐下降， 而慢性排斥反应一直是较难控制的问题。由此， 对T细胞活化与耐受的调节成为大家关注的重点， 而免疫抑制剂对患者淋巴细胞的调节作用就显得尤为重要。

　　本研究结果显示， 无论是疾病对照组还是移植后肝移植受者组， 其T淋巴细胞总数均未发生明显变化， 但终末期肝脏疾病患者有明显的T细胞亚群平衡的严重偏移， 并以CD4+T细胞活跃亢进为主。该组患者CD4+T细胞的高表达可辅助其B细胞功能亢进， 促进体液免疫功能亢进和浆细胞活化增殖并分泌大量免疫球蛋白， 从而与终末期肝病患者血浆白蛋白/球蛋白比例倒置和密切相关。肝移植术后接受免疫抑制治疗后， 钙调磷酸酶抑制剂FK506和CsA并不影响T细胞的生成， 但T细胞亚群的失衡却得到明显改善， CD4+T细胞表达明显降低、 CD8+T细胞表达回升、 CD4/CD8 T细胞比值降低， 且均恢复到正常水平。提示， FK506与CsA抑制Th细胞的功能为主。进一步分析不同免疫抑制剂组的T细胞亚群表达结果时我们发现， 尽管两治疗组T细胞亚群表达均恢复到正常水平， 但FK506和CsA对T淋巴细胞亚群的调节作用存在明显不同: FK506治疗组的CD4+T细胞明显低于CsA治疗组， CD8+T细胞水平高于CsA治疗组。提示在常规血药浓度条件下， FK506对CD4+T细胞的抑制能力及对CD8+T细胞的增强作用均明显强于CsA。

　　CD28、 CD152、 ICOS（inducible costimulator）分子同属CD28共刺激分子家族［4］。 CD28与CD152是一对参与T细胞增殖活化的互为拮抗的共刺激信号分子， CD28具有正向调节功能， 其对T细胞的活化有重要的加强作用; 而CD152则具有负向调节功能， 其与配体结合后可通过产生抑制性信号或与CD28竞争B7受体从而抑制T细胞活化。在CD28信号存在时， CD152还可对CD8+T细胞的活性进行抑制［4-7］。ICOS分子又被称为AILM（activation inducible lymphocyte immunomordulatory molecule）， 其表达于活化的T细胞上。ICOS的配体B7h表达于静止的B细胞、 DC细胞和单核细胞上， 其不与CD152、 CD28或PD1结合［8， 9］。

　　本研究结果还显示， 终末期肝脏疾病患者CD4+T细胞与CD8+T细胞上的正向调节信号分子CD28和负向调节信号分子CD152的表达均明显高于健康对照， 但维持T淋巴细胞活化效应的正向调节信号分子ICOS表达明显低于健康对照。CD4+T细胞上CD28分子的高表达与CD4+T细胞的高表达同步， CD4+T细胞上高表达的CD152与ICOS分子表达的降低密切相关。提示， 参与终末期肝脏疾病患者T淋巴细胞亚群功能调节的主要信号分子是CD28和CD152分子对。

　　术后接受免疫抑制治疗两月后， 肝移植受者CD4+T细胞与CD8+T细胞上正性共刺激分子CD28、 ICOS表达均明显低于健康对照组， 而负性调节信号分子CD152水平明显高于健康对照组， 提示肝移植术后肝移植受者组T细胞亚群的平衡得以纠正与T淋巴细胞亚群上共刺激分子的活化表达受到免疫抑制剂的调控有关。钙调磷酸酶抑制剂能够有力地控制正向调节信号分子的表达并促进负向调节信号分子的表达， 从而达到抑制T细胞免疫排斥效应而使肝移植术后治疗患者出现免疫耐受的目的。在该抑制调节作用中， 进一步比较FK506 和CsA对信号分子的调节作用时发现， FK506对CD28信号分子的表达有明显的抑制作用， 而CsA对CD28分子的抑制作用不明显; FK506与CsA均有启动CD152负性信号调节通路的功能， 且CsA对CD152负性信号分子的促进作用显著强于FK506。启动CD152负性信号通路、 诱导肝移植受者T细胞无能是钙调磷酸酶抑制剂的主要作用机制之一。

　　本研究结果提示， FK506和CsA的免疫调节作用靶点存在差异。二者均能迅速纠正移植受者T淋巴细胞亚群紊乱， 但在常规血药浓度条件下， FK506对T细胞亚群的调节作用强于CsA。FK506可同时抑制正性共刺激分子CD28和ICOS表达并促进负性共刺激分子CD152表达， 而CsA对T细胞免疫抑制作用主要是通过促进CD152分子的高表达介导。

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