人核迁移蛋C刺激人造血干细胞增殖分化为巨核细胞研究

　　　　 作者：陈彦球， 葛怡琛， 徐培林， 杨燕

【摘要】 目的: 研究人核迁移蛋C（hNUDC）促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用。方法: 使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞， 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后， 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、 中、 大巨核细胞集落的形态、 数目的影响; 无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后， 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果: hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达， CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论: hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。

【关键词】 人核迁移蛋白; 巨核细胞; DNA倍性

　　［Abstract］ AIM: 　To study the effect of human nuclear distribution C （hNUDC） on human megakaryocyte proliferation and differentiation from cord blood CD34+ cells in vitro. METHODS: 　 Human CD34+ cells were isolated using the Dynal CD34 Progenitor Cell Selection System from umbilical cord blood. The CD34+ cells were then cultured in serum free methylcellulose semisolid media， the morphologic aspects and number of small， medium and large CFUMK colonies were observed and scored on the day12 by microscopy analysis. The CD34+ cells were cultured in serum free liquid media， cells were removed on day 10 and formation of CD41+ in human megakaryocyte and its DNA polyploidization of nuclear were analyzed on a FACsort flowcytometer. RESULTS: 　hNUDC supported the formation of small and medium CFUMK colony in serum free semisolid media. Furthermore， hNUDC induced a remarkable increase in expression of the megakaryocyte cell surface marker CD41+ and stimulated the CD41+ DNA polyploidization more effectively than TPO. CONCLUSION: hNUDC may play an important role in megakaryocyte proliferation and differentiation.

　　［Keywords］hNUDC; Megacaryocyte; DNA polyploidization

　　［摘 要］ 目的: 研究人核迁移蛋C（hNUDC）促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用。方法: 使用Dynal CD34体外分离系统收集人脐血CD34+细胞， 无血清甲基纤维素半固体法体外培养CD34+细胞12 d后， 显微镜下观察hNUDC对CD34+细胞分化增殖为小、 中、 大巨核细胞集落的形态、 数目的影响; 无血清液体培养体系培养CD34+细胞10 d后， 流式细胞术检测hNUDC对CD34+细胞分化增殖为CD41+细胞的表达率及其DNA倍性的影响。结果: hNUDC能够明显促进CD34+细胞分化增殖形成中小型CFUMK集落， 可显著增加巨核细胞表面标志物CD41+的表达， CD41+细胞中DNA倍性显著地高于血小板生成素。结论: hNUDC对促进造血干细胞增殖和分化为巨核细胞具有重要作用。

　　［关键词］人核迁移蛋白; 巨核细胞; DNA倍性

　　血小板生成素（thrombopoietin， TPO）在体外具有调节巨核细胞增殖、 成熟和血小板形成的功能［1］。但研究发现TPO基因敲除小鼠的血小板计数虽然比正常小鼠降低了85%， 但这些小鼠并没有发生出血现象， 仍具有形态正常的巨核细胞和血小板［2］。因此推测， 很可能存在有其他因子， 与TPO一起参与巨核细胞和血小板生成的调控过程。核迁移蛋白C (nuclear distribution C， NUDC)在核迁移中起着关键的作用， NUDC与其家族成员相互作用［3］， 和微管一起参与细胞增殖［4］、 正常的造血、 神经迁移和脑发育。在增生的细胞中可以观察到NUDC强烈的免疫标记， NUDC的水平在红系祖细胞中最高， 在正常人骨髓中， 早期骨髓祖细胞和红系祖细胞中， 人核迁移蛋白C （hNUDC）和mRNA有高水平表达。我们使用重组hNUDC 蛋白， 成功制备了 hNUDC单克隆抗体（mAb）， 前期实验结果表明， hNUDC 蛋白呈点状分布于人巨核细胞、 巨核系白血病细胞株Meg01、 Dami的细胞膜与细胞核中， 而且hNUDC可以特异地与血小板生成素受体（Myeloproliferative leukemia， Mpl）特异地结合， 对于小鼠的巨核细胞系和血小板的生成， 具有与TPO类似的生物活性［5］; 表明hNUDC很有可能是巨核细胞增殖分化调控中一个重要的因子。为进一步确证并检测hNUDC蛋白是否具有参与巨核细胞和血小板生成调控的生物活性， 我们选择正常人脐带血的造血干细胞， 在体外实验观察hNUDC对造血干细胞增殖、 分化的作用， 为脐血巨核系定向扩增的基础研究和临床应用摸索条件， 提供新的研究思路。

1 材料和方法

　　1.1 材料 Dynal CD34 祖细胞分选系统购自 Dynal Biotech公司; 造血干细胞无血清培养液StemSpan h3000购自Stem Cell Technologies公司; 淋巴细胞分离液购自Amersham Biosciences公司; IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)培养基粉末购自Gibco公司。青霉素和链霉素、 rhTPO、 甲基纤维素均购于Sigma公司。FITC标记的抗人CD41抗体、 抗人IgG抗体购于Biolegend公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫磁珠分离法体外分离人脐血CD34+ 细胞 每份脐血均取自广东省造血干细胞库， 样品经产妇正式同意后来自足月分娩的胎儿。 脐血平均采集量为50～80 mL， 用分离缓冲液将肝素抗凝的脐血1∶4稀释， 淋巴细胞分离液 FicollHypaque (JPrep) 水平离心机密度梯度离心， 收集界面层单个核细胞， 用相同体积的分离缓冲液悬浮混匀细胞， 500 g离心20 min; 用分离缓冲液重悬沉淀细胞， 300 g离心20 min; 取沉淀， 将细胞用冰预冷的分离缓冲液重新悬浮至4×1010～4×1011/L， 总体积至少到1 mL。按照Dynal CD34祖细胞分选系统操作说明进行脐血CD34+细胞分选， 得到纯化的CD34+细胞， 细胞计数后用流式细胞仪定量分析分离前后样品中CD34+细胞表达率， 计算纯度和回收率。

　　1.2.2 hNUDC蛋白的表达、 纯化以及实验分组设计 hNUDC蛋白的表达、 纯化的具体方法

参考文献

［5］。实验设正常对照组、 TPO 阳性对照组（终浓度为50 μg/L）和 hNUDC 蛋白不同浓度组（终浓度为 50、 100、 500 μg/L）。正常对照组为 pET28大肠杆菌表达系统空载体， 经过与表达 hNUDC 和组氨酸亲和柱纯化hNUDC相同的处理过程， 最后溶解于含1 g/L BSA 的 PBS 缓冲溶液中。

　　1.2.3 hNUDC对CFUMK集落形成的影响 使用9 g/L甲基纤维素无血清半固体培养， 每毫升培养体系为含5×103个CD34+细胞、 常规剂量链/青霉素以及各种浓度的rhTPO 或hNUDC蛋白， 接种在35 mm 培养皿， 每组重复3个培养皿， 每个培养皿1.5 mL。置37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度的孵育箱中培养12 d后计算CFUMK集落数， 根据每个CFUMK集落中包括的巨核细胞数目， 将CFUMK集落分为3类。(1)CFUMK小集落（small CFUMK colony）: 包括3～20个巨核细胞; (2)CFUMK中集落（medium CFUMK colony）: 包括21～49个巨核细胞; (3)CFUMK大集落（large CFUMK colony）: 包括≥50个巨核细胞。倒置显微镜下分别计算大、 中、 小集落数。本实验重复3次。

　　1.2.4 hNUDC对CD41+细胞阳性表达率的影响 5 mL的无血清培养液体系中含1×104人脐带血CD34+细胞， 无血清培养基StemSpan h3000， 不同浓度的hNUDC蛋白、 TPO和相同体积的对照液体PBS。 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养， 每3～4 d半量换液1 次。培养10 d后收集细胞， 用PBS缓冲液洗3次后， 加入FITC标记的抗人CD41抗体， 同时用FITC标记的抗人IgG抗体作为阴性对照， 4℃孵育30 min， 用PBS缓冲液洗3次后， 用-20℃预冷的乙醇固定细胞， 采用双色FACSVantage流式细胞仪定量分析CD41+细胞阳性表达率。

　　1.2.5 hNUDC对CD41+细胞的DNA含量和倍性的影响 细胞收集与标记方法同上， 用-20℃ 预冷的乙醇固定细胞并透膜后， PI (propidium iodide)染色， 采用双色FACSVantage流式细胞仪定量分析CD41+细胞的DNA含量和倍性。

　　1.2.6 动态观察脐血CD34+细胞液体培养体系中 CD41+细胞形态和数目 倒置显微镜下， 在培养第7、 10天动态观察hNUDC与TPO对CD34+造血干细胞形态学的影响。培养第10天收集培养的细胞进行吉姆萨染色观察。

　　1.2.7 统计学分析 实验数据以x±s表示， 所有数据均采用SPSS/PC11.5软件分析， 统计方法为单因素方差分析LSD法， 其中CD41+细胞的表达率及其DNA含量的比较先行平方根反正弦变换（Y=arcsinx ）变换， 以P&<0.05为有统计学意义。

2 结果

　　2.1 体外分离脐血单个核细胞和CD34+细胞 每次采集的抗凝处理后脐血在40～ 60 mL之间， 经淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞。去黏附细胞后得(0.98±0.33)×108的单个核细胞 ［(0. 7～1. 3)×108 ］， CD34 +细胞比例为(1.20±0.33)% ［(0. 8～1. 7)%］。流式细胞术测定分离前后样品中CD34+百分含量分别为3.2%和95.3%。本次实验中应用的免疫磁珠分离系统一次吸附过滤的CD34+干细胞的平均纯度达到88%。从1×108个界面细胞， 平均可以分离获得1×106 CD34+干细胞。

　　2.2 hNUDC对CD34+细胞增殖分化为CFUMK集落的作用 对照组只有小型CFUMK集落生长， hNUDC在50 μg/L时即能促进CFUMK小集落生长， 与对照组比较差异有统计学意义(P&<0.01); 随着hNUDC浓度增大到100 μg/L时， 其效应进一步增强。但是随着hNUDC浓度的增大到500 μg/L时， CFUMK中集落和大集落都有生长， 与正常对照组相比差异有统计学意义(P&<0.01)， 但其效应并不随着hNUDC浓度增大而增强， 相反比较100 μg/L时有所下降。TPO 在50 μg/L时对大、 中、 小型CFUMK都有明显的促进生长作用， 主要产生CFUMK大集落， 且数目显著高于hNUDC各个剂量组生成的CFUMK大集落数， 差异有统计学意义(P&<0.01， 表1)。表1 hNUDC 对CD34+细胞增殖分化为CFUMK的影响

　　2.3 hNUDC对CD34+细胞分化为CD41+细胞的作用 人脐带血CD34+细胞与不同剂量组的hNUDC液体培养10 d后， 对照组CD41+细胞百分含量仅为5.43%; 50 μg/L和100 μg/L剂量的hNUDC组的CD41+细胞百分含量分别34.03%和43.56%， 明显高于对照组 (P&<0.01) 。而 500 μg/L剂量的hNUDC组的CD41+细胞百分含量却明显下降， 仅为2.95%， 显著低于对照组和50 μg/L、 100 μg/L hNUDC组 (P&<0.01); TPO组CD41+细胞百分含量为最高， 达到78.02%。

　　2.4 hNUDC对CD41+细胞DNA倍性的作用 单独经过50 μg/L和 100 μg/L hNUDC培养后细胞的DNA含量明显高于对照组 (P&<0.01); 50 μg/L hNUDC 组CD41+细胞的DNA倍性分布中， 二倍体、 四倍体和八倍体的比例与TPO组相近， 但16倍体和32倍体的分布则明显高于TPO组 (P&<0.01)。100 μg/L hNUDC 组DNA含量中四倍体、 八倍体、 16倍体和32倍体的含量较50 μg/L hNUDC 组升高， 并且均高于TPO组 (P&<0.01)。而 500 μg/L hNUDC组的DNA含量仅为36.32%， 主要为二倍体和四倍体。TPO组的DNA倍性分布以二倍体为主要组成， 四倍体、 八倍体和16倍体的比例分别为14.26%， 7.68%和2.70%， 32倍体的含量很低， 仅为0.14%(表2)。表2 hNUDC对脐带血CD34+细胞液体培养后CD41+细胞DNA倍性的作用

　　2.5 hNUDC培养不同时间对CD41+细胞形态的作用 使用hNUDC蛋白单独培养人脐带血CD34+细胞后的第7天， 可以观察到许多“巨大细胞”形态的巨核细胞， 在第10天达到最多， 大部分细胞成为成熟巨核细胞， 部分细胞还伴随有前血小板的形成。100 μg/L hNUDC剂量组的效果最好， 500 μg/L hNUDC剂量组的“巨大细胞”数量低于50 μg/L和100 μg/L hNUDC剂量组。TPO单独使用后， 在第5天就可以观察到许多“巨大细胞”形态的巨核细胞， 并随着培养时间延长增多变大。在第10天， 收集各组细胞进行吉姆萨染色 (图1)， 可见单独经过100 μg/L hNUDC培养后， 倍性为四倍体、 八倍体的巨核细胞所占比例较多， 并且部分细胞已经进入前血小板状态。TPO组中的大部分细胞的细胞核为二倍体和四倍体， 进入前血小板状态的细胞很少见到。对照组中的细胞几乎全部为不成熟的原始干细胞， 表现为淋巴母细胞样的祖细胞形态， 细胞核多为深染的单核细胞， 部分为二倍体细胞， 但体积很小。图1 hNUDC对人CD34+细胞培养10 d后形态学的影响

3 讨论

　　血小板的形成极其复杂， 是多水平调控的生物学过程。包括多潜能造血干细胞向巨核细胞分化、 增殖。在巨核细胞趋于成熟时细胞核经数次分裂成为多倍体， 但胞体不分裂， 在产生血小板之前细胞呈不规则形状， 细胞伸出细长的微管， 微管的顶端连着突起的胞质， 胞质膨大后脱落即成血小板。这一过程又称前血小板(proplatelet)生成过程［6］。然而前血小板生成以及血小板释放的过程目前仅仅是假设， 几十年来一直是人们关注的课题。TPO是血小板形成中一个最重要的细胞因子［1］， 但是研究表明TPO并不是必不可少［2］， TPO受体mRNA表达量的增加并不受TPO的影响［7］。另有实验证明， TPO只作用于巨核细胞的增殖及早期成熟时期， 对巨核细胞后期成熟尤其对前血小板的生成没有明显的促进作用［8］。本实验以TPO作为阳性对照， 其结果与以往研究的报导结果一致。

　　为研究hNUDC促进人脐血来源的CD34+细胞增殖、 分化为巨核细胞的作用， 本实验在无血清甲基纤维素培养系统中加入不同浓度的hNUDC蛋白， 结果显示在hNUDC存在条件下， 生长的CFUMK集落主要为包括3～50个巨核细胞的CFUMK 中小集落。而TPO 在 50 μg/L时对大、 中、 小型CFUMK都有明显的促进生长作用， 主要产生的集落为包括≥50个巨核细胞的CFUMK大集落。一般认为， CFUMK大集落生长来源于较原始的巨核祖细胞， 而中小型的CFUMK集落生长来源于较成熟的巨核祖细胞。我们发现不同剂量组的hNUDC均能促进CFUMK小集落形成， 因此说明hNUDC能够在体外直接作用于较成熟的巨核祖细胞， 促进巨核祖细胞细胞分化增殖形成集落， 对巨核细胞具有促进增殖和分化的作用。

　　在无血清液体培养系统中添加hNUDC蛋白， 纯化后的CD34+细胞向着巨核系细胞分化， 并表达巨核系细胞特异的表面标志物CD41。随着CD34+ CD41+巨核系定向祖细胞向成熟的巨核系细胞分化， CD41 抗原表达明显增加， 并且细胞的DNA含量高于对照组。值得注意的是CD41+细胞的DNA倍性分布中， 二倍体、 四倍体和八倍体的比例与TPO组相近， 但16倍体和32倍体的分布则明显高于TPO组。吉姆萨染色进一步确证了hNUDC培养后的人脐带血分化后细胞形态学变化， 巨核细胞倍性增加， 细胞质更加成熟， 其效果明显优于TPO。

　　本实验结果提示， hNUDC对巨核细胞活性的作用可能主要集中于巨核细胞的后期成熟阶段， 尤其是巨核细胞的多倍体化与胞质成熟阶段或者血小板生成的阶段。 hNUDC很可能是促进造血干细胞向巨核系分化及诱导成熟的晚期作用的重要因子。但是对于其重要作用机制以及与其他调控因子的相互作用还需要进一步深入研究。

参考文献

［1］ Zheng C， Yang R， Han Z， et al. TPOindependent megakaryocytopoiesis［J］. Crit Rev Oncol Hematol， 2008， 65(3): 212-222.

［2］ Bruno S， Gunetti M， Gammaitoni L， et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex vivo expanded cord blood cells: Rapid and transient megakaryocyte reconstitution［J］. Haematologica， 2003， 88(4): 379-387.

［3］ Gocke CD， Osmani SA， Miller BA. The human homologue of the Aspergillus nuclear migration gene nudC is preferentially expressed in piding cells and ciliated epithelia［J］. Histochem Cell Bioll， 2000， 114(4): 293-301.

［4］ Zhang MY， Huang NN， Clawson GA， et al. Involvement of the fungal nuclear migration gene nudC human homolog in cell proliferation and mitotic spindle formation［J］. Exp Cell Res， 2002， 273(1): 73-84.

［5］ Pan RM， Yang Y， Wei MX， et al. A microtubule associated protein (hNUDC) binds to the extracellular domain of thrombopoietin receptor (Mpl)［J］. J Cell Biochem， 2005， 96(4): 741-750.

［6］ Hartwig J， Italiano Jr J. The birth of the platelet［J］. J Thromb Haemost， 2003， 1(10): 1580-1586.

［7］ CohenSolal K， Vitrat N， Titeux M， et al. Highlevel expression of Mpl in platelets and megakaryocytes is independent of thrombopoentin［J］. Blood， 2000， 93(9): 2859-2866.

［8］ Qian H， BuzaVidas N， Hyland CD， et al. Critical role of thrombopoietin in maintaining adult quiescent hematopoietic stem cells［J］. Cell Stem Cell， 2007， 1(6): 671-684.