CD4+CD25+/highCD127lowTregs及TGFβ在多发性骨髓瘤患者外周血的表达分析

　　　　作者：韩文敏， 邱国强， 周民， 任敏， 谢晓宝

【摘要】 目的: 初步探讨CD4+CD25+/highCD127lowT调节性T细胞（Tregs）及TGFβ在不同病程阶段多发性骨髓瘤 (MM)患者外周血中的表达水平， 并研究患者血清TGFβ水平是否与CD4+CD25+/highCD127lowTregs具有相关性。方法: 流式细胞术（FCM）检测50例MM患者及30例健康志愿者外周静脉血CD4+CD25+/highCD127lowTregs细胞的比例并分析比较。ELISA法定量检测血清TGFβ的表达水平。结果: (1)化疗后组CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的比例均显高于初诊组及正常对照组; 初诊组与正常对照组的CD4+CD25+CD127lowT细胞相比无统计学意义， 但其CD4+CD25highCD127lowT细胞明显高于正常对照组。(2)化疗后稳定期CD4+CD25+CD127lowT细胞与活动期没有差异， 但其CD4+CD25highCD127lowT细胞明显低于活动期。(3)MM各组TGFβ水平均较对照组明显升高， 但各组比较无统计学意义。(4)TGFβ与CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的表达水平均不成相关性。结论: CD4+CD25+/highCD127low调节性T细胞MM患者外周血中比例明显升高， 且化疗及疾病进展程度可能影响其在外周血的比例。TGFβ可能不是导致其比例增加的直接原因。

【关键词】 多发性骨髓瘤; CD4+CD25+调节T细胞; TGFβ; 流式细胞术

　　多发性骨髓瘤(multiple myeloma， MM)患者的多种免疫缺陷影响抗肿瘤免疫应答和免疫治疗， 因此深入了解骨髓瘤患者的免疫功能有利于引入和优化新的免疫治疗策略。研究表明， 肿瘤的发生与机体免疫逃避有关， CD4+CD25+Tregs是一群具有免疫负调控功能的T细胞亚群， 在维持对自身成分免疫耐受的同时， 也可能阻止了机体对自体同源肿瘤细胞的免疫， 导致肿瘤的免疫抑制及免疫逃逸［1］。利用流式细胞术（FCM）检测了50例MM患者外周血CD4+CD25+/highCD127lowTregs和TGFβ的表达水平， 并将这些改变与临床资料进行比较分析， 初步探讨其与MM发生、 发展的关系及其临床意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 PE标记的鼠抗人CD25抗体， FITC标记的鼠抗人CD4抗体， Percp标记的鼠抗人CD4抗体， PE标记的鼠抗人CD127抗体， FITC标记的鼠抗人CD25抗体， PE及FITC同型对照的鼠抗人IgG1及鼠抗人 IgG2a， 和FACS Calibur流式细胞仪均为美国Becton Dickinson（BD）公司产品。TGFβ ELISA试剂盒购自深圳晶美生物公司。50例MM患者来自苏州大学附三院、 常州市第二人民医院、 常州市武进医院2006-12/2007-11门诊或住院治疗的患者， 所有患者均符合国内MM诊断标准［2］。其中男33例， 女17例， 年龄41～89岁， 平均年龄63岁。免疫球蛋白分型IgG20例， IgA10例， IgD2例， IgM1例， 轻链型17例。据Salmon和Durie分期Ⅰ期3例， Ⅱ期14例， Ⅲ期33例。初诊MM患者16例， 多程化疗后34例。正常对照30名， 为健康志愿者， 男18名， 女12名， 平均59（45～82）岁。均无肿瘤及自身免疫性疾病史。

　　1.2 方法

　　1.2.1 FCM检测外周血CD4+CD25+/highCD127lowTregs 所有观察对象均于清晨空腹抽取静脉血2～4 mL， EDTA抗凝。应用荧光直接标记法及FCM检测外周血CD4+CD25+Tregs细胞水平。取外周血100 μL置于FCM检测管中， 分别加入不同荧光标记的单克隆抗体(mAb)各20 μL， 4℃暗室孵育30 min后， 每管各加本实验室配制的溶血素3 000 μL， 充分打匀后置室温孵育12 min， 1 000 r/min离心5 min， 弃上清加鞘液500 μL， 用FCM检测。先以前向散射角(FSC)及侧向散射角(SSC)确定淋巴细胞群， 再以CD4+T细胞为门， 分析CD4+T细胞上CD25与CD127的表达， 计算CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的百分比。Cellquest或WinMDI2.9软件分析数据， 记录阳性细胞百分率， 减去非特异对照值， 各指标均换算成占外周血CD4+T细胞的比例， 每次均收集细胞50 000。以CD4+ T细胞中表达CD25荧光强度&>CD4-T细胞中CD25荧光强度者定义为CD4+CD25highT细胞， 利用以上CD4+CD25+及CD4+CD25high的界限联合群体区分来界定CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞群体。

　　1.2.2 ELISA法检测血清TGFβ浓度 干燥管抽取MM及健康者外周静脉血2 mL， 静止30 min后， 3000 r/min离心10 min， 收集血清， -80度冰箱冻存， 应用双抗体夹心ELISA方法严格按试剂盒操作说明检测。

　　1.2.3 统计学分析 所有数据以x±s表示， 独立t检验、 一元方差分析均由SPSS10.0 for Windows统计软件完成。 2 结果

　　2.1 初诊及化疗后MM患者外周血CD4+CD25+/highCD127lowTregs与TGFβ的表达水平 50例MM患者据有无接受过化疗分初诊组16例及多程化疗后组34例。化疗后组CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞的比例均高于正常组和初诊组， 差异具有统计学意义（P&<0.01）; 初诊组CD4+CD25+CD127lowT细胞与正常对照组无统计学意义（P&>0.05）， 但其CD4+CD25highCD127lowT细胞与正常对照组比较差异具有统计学意义（P&<0.05）。初诊组和化疗后组TGFβ水平均明显高于正常组， 但两组之间无统计学意义（表1， 图1）。 表1 初诊组、 化疗后组和正常对照组外周血CD4+CD25+/highCD127lowT细胞和TGFβ的表达水平

　　2.2 活动期和稳定期MM患者外周血CD4+CD25+/highCD127lowTreg与TGFβ的表达水平 34例化疗后MM患者中活动期18例（复发或未缓解患者）， 稳定期16例（平台期及完全缓解或部分缓解）。稳定期CD4+CD25+CD127lowT细胞与活动期相比无统计学意义， 但CD4+CD25highCD127lowT细胞明显低于活动期（P&<0.01）。两组TGFβ的表达水平无统计学意义（表2）。 表2 活动期和稳定期外周血CD4+CD25+/highCD127lowT细胞和TGFβ的表达水平

　　2.3 MM患者外周血CD4+CD25+/highCD127low Tregs与TGFβ的表达水平的相关性分析 50例MM患者CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞与TGFβ的表达水平无明显相关性(r值分别为0.186， 0.136， P值分别为0.196， 0.347)。

3 讨论

　　近来相继有研究发现高表达于非调节性T细胞的CD127（IL7的受体）在调节性T细胞表面却是低表达的， HartiganO’Connor等用CD4， CD25， CD127三色抗体标记， 发现人类、 鼠及短尾猴外周血存在群体较清晰CD4+CD25+/highCD127lowT细胞， 它们高表达胞内标记Foxp3和CTLA4， 功能分析发现其具有抑制性， 低增值性和对TCR信号的低反应性［3］。因此我们认为CD127联合CD4， CD25 FCM检测可以准确的反映该群细胞的表达水平。本实验中将CD4+CD25+/highCD127lowT细胞分成2个群体分别比较分析， CD4+CD25highCD127lowT比CD4+CD25+CD127lowT表达更多的Foxp3、 CTLA4， 能更快的活化并上调Foxp3的表达， 表现出更强大的抑制功能［3］。检测MM化疗后组CD4+CD25+CD127low， CD4+CD25highCD127lowT均高于正常对照组。初诊组CD4+CD25highCD127lowT细胞也明显高于对照组。因此， MM体内存在CD4+CD25+调节性T细胞的异常。研究还发现治疗后MM患者， 外周血里的CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞均较初诊组明显升高， 提示化疗可能对患者体内调节性T细胞起着重要作用。因有研究表明某些化疗药物如糖皮质激素可能诱导产生CD4+CD25+ Tregs［4］。本实验中所有患者均有接受包含地塞米松的化疗方案， 因此药物对CD4+CD25+Tregs的影响不能排除。另外， 经过化疗后病情仍未稳定（活动期）的患者CD4+CD25highCD127lowT细胞较稳定期明显升高， 说明活动期患者的免疫抑制更严重。活动期增殖活跃的瘤细胞， 直接导致调节性T细胞外周抗原依赖的扩增还是其分泌的一系列细胞因子间接引起调节性T细胞的升高， 需要进一步研究。但病情趋于稳定后， 调节性T细胞虽有下降但还是较正常人明显升高， 说明稳定期的患者免疫功能并未完全恢复。

　　作为介导免疫耐受的重要细胞因子， TGFβ不仅是CD4+CD25+Tregs抑制功能发挥的重要因子， 近来有研究证实TGFβ可以通过某些途径调控人CD4+T细胞Foxp3表达， 促进CD4+CD25-T细胞表达Foxp3转化成CD4+CD25+调节性T细胞［5］。而TGFβ与MM关系密切， 骨髓瘤细胞和骨髓基质细胞都分泌高水平的TGFβ， 并促进其他细胞因子如IL6和VEGF的分泌［6］。体内过多的TGFβ会不会是引起MM患者体内调节性T细胞升高的重要原因呢［7］。我们通过检测MM患者血清TGFβ水平， 发现初诊和化疗后组TGFβ表达均高于对照组， 但初诊和化疗后组及活动期和稳定期两组的TGFβ表达并没有差异， 说明TGFβ在MM患者外周血中明显升高， 但其水平并不随化疗和疾病的进展而变化， 值得进一步研究。MM患者CD4+CD25+CD127low、 CD4+CD25highCD127lowT细胞与TGFβ的表达水平无明显相关性， 首先说明TGFβ或许不是导致MM患者体内调节性T细胞增加的重要或惟一因素， 是否存在其他细胞因子（如IL10）［8］或其他途径尚需探讨， 有研究提示荷瘤小鼠体内CD4+CD25+调节性T细胞的扩增可能与树突状细胞提呈的肿瘤相关抗原有关［9］; 其次， 由于我们只分析了患者外周血中TGFβ的表达水平， 没有对MM患者体内调节性T细胞进行分离培养并检测其本身分泌TGFβ的能力， 研究表明调节性T细胞作用机制的发挥除依赖可溶性细胞因子模式外还可通过GITR、 CTLA4等细胞细胞接触依赖的模式［10］。因此， 什么机制引起MM患者体内调节性T细胞的升高及调节性T细胞分泌的TGFβ是否是参与其抑制功能发挥的主要机制， 有待进一步研究。

　　总之， 本实验结果显示CD4+CD25+/highCD127low调节性T细胞在MM患者外周血中比例明显升高， 但TGFβ可能不是导致其升高的主要原因。因此以CD4+CD25+调节性T细胞为基础的免疫治疗将为MM的治疗提供新的参考。

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