小鼠双尾C蛋白Bicc1多克隆抗体的制备及细胞内定位的初步研究

　　 作者：戴宝贞， 周亮， 付玉龙， 丁镇伟， 李煜， 吴冠青

【摘要】 目的: 制备小鼠双尾C蛋白Bicc1的多克隆抗体并确定其在细胞内定位。方法: 根据生物信息学分析结果， PCR扩增小鼠Bicc1编码61E199A的cDNA片段。将该片段克隆到GST融合蛋白表达载体上， 在IPTG诱导下产生Bicc1N抗原。纯化目的蛋白并制备兔抗Bicc1蛋白多克隆抗体。Western blot鉴定抗体特异性， 并以间接免疫荧光法初步分析该蛋白在细胞内定位。结果: 成功构建Bicc1N片段原核表达载体， 在大肠杆菌中实现可溶性表达， 制备小鼠Bicc1蛋白的多克隆抗体， 并证实该蛋白主要表达于细胞质内。结论: 成功制备了高效价并特异的兔抗Bicc1多克隆抗体， 为进一步研究Bicc1基因产物的生物功能奠定了基础。

【关键词】 小鼠双尾C基因; Bicc1; 多克隆抗体; 多囊肾

　　双尾C基因 (BicaudalC)首先在果蝇（Drosophila）中发现， 其功能丧失导致果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎头部的缺失和双尾结构的形成［1］。随后相继在线虫、 爪蟾、 小鼠和人类等物种中发现了果蝇BicaudalC（dBicC）的同源基因。这些同源基因在进化上高度保守: 其蛋白产物均含有N端若干个KH结构域（K homology RNAbinding domain）和C端的一个SAM（Sterile alpha motif）结构域， 它们是蛋白发挥生物功能的关键结构域［2］。KH结构域是RNA结合结构域， 含有该结构域的蛋白通过与RNA结合， 参与mRNA的剪接和翻译， 并维持RNA的稳定性［2， 3］。BicaudalC蛋白C末端的SAM（Sterile alpha motif）结构域一般被认为介导蛋白质之间相互作用， 促进蛋白质同源或异源二聚体的形成［4］。

　　不同物种BicaudalC同源基因的功能已部分阐明。除了前述果蝇BicC蛋白在发育中的作用， 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的GLD3蛋白能够促进生殖细胞减数分裂并引发精子发生过程［5］; 爪蟾（Xenopus）的xBicC蛋白则通过与RNA的结合涉及早期胚胎发育的胚层特化［6］; 而小鼠Bicc1和人类BICC1基因功能目前还知之甚少［7］。Bicc1基因突变的小鼠表现出与人类多囊肾疾病高度相似的症状， 因而该基因突变的小鼠成为研究人类多囊肾疾病发病机制的理想模型。其中jcpk（juvenile congenital polycystic kidney disease）纯合子小鼠模型的表型与人类常染色体显性多囊肾疾病（autosomal dominant polycystic kidney disease， ADPKD）极为相似， 双侧所有肾单元均发生囊肿， 一般出生后10 d死亡。此外， 该基因的突变还影响其他器官如肝脏和胰腺的正常发育和生理功能［7］。

　　以上证明Bicc1基因突变与小鼠多囊肾的形成密切相关， 提示该基因产物的功能可能与人类多囊肾疾病的发生相关。本研究拟制备小鼠Bicc1蛋白的特异性多克隆抗体， 并分析该蛋白在细胞内的表达分布， 从而为进一步研究小鼠Bicc1基因的功能奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性日本大耳白兔（1.5～2.0 kg）购自中国医科院实验动物中心; Rosetta工程菌为Novagen公司产品; 超滤离心管（截流≥10 KD）为赛多利斯公司产品; LA Taq DNA聚合酶、 限制性内切酶为大连宝生物公司产品; 质粒提取、 PCR产物纯化、 反转录试剂盒及T4连接酶试剂盒为Promega公司产品; TRIzol试剂、 脂质体2000为Invitrogen公司产品; AntiGST单克隆抗体（mAb）为北京天根生化公司产品; DAPI、 Protein G Agarose为Roche公司产品; 弗氏佐剂、 IPTG、 及Flag mAb为Sigma公司产品; 分别标记Cy2、 Cy3的二抗为Jackson ImmunoResearch Laboratories公司产品; DYCP43型蛋白质回收电泳槽为北京六一仪器厂产品; 载体pCMVTag4A为Stratagen公司产品; pGEXHisC3购自Promega公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠Bicc1基因的扩增和真核表达载体的构建 按照相应产品说明书提取小鼠肾脏组织总RNA， 并反转录为cDNA。以该cDNA为模板， 以5′GAGCTCATGGCCTCGCAGAG3′（含有Sac I）和5′GGATCCCTACCAGCGGCCACTG3′ （含有BamH I）为引物进行PCR扩增。循环参数为94℃ 5 min， 94℃ 1 min， 58℃ 1 min， 72℃ 3.5 min， 30个循环; 72℃ 10 min。将PCR产物连入pGEMTeasy载体， 获得重组质粒经测序后， 选择完全正确的质粒用Sac I、 BamH I和Sca I三酶切， 将Bicc1基因片段连入经Sac I和BamH I双酶切的pCMVTag4A载体， 从而获得带有Flag标签的Bicc1真核表达载体pCMVTag4ABicc1。

　　1.2.2 小鼠Bicc1蛋白抗原区段的选择、 PCR扩增及原核表达载体的构建 首先利用SMART Tool（Simple Modular Architecture Research Tool， heidelberg.de）分析小鼠Bicc1蛋白二级结构， 并使用DNAStarProtean软件分析该蛋白的抗原指数、 表面可及性以及亲水性， 选择3种指标均较好的区段作为抗原区。以pGEMTeasyBicc1载体为模板， 以5′GAATTCGAGGCCATGCTCCAAGC3′（含有EcoR I）和5′CTCGAGTGCTCGGGCCGATTCTAC3′(含有Xho I)为引物进行PCR扩增; 循环参数为94℃ 5 min; 94℃ 45 s; 58℃ 45 s; 72℃ 45 s， 5个循环; 94℃ 45 s; 72℃ 45 s， 25个循环; 72℃ 10 min。将PCR产物连入pGEMTeasy载体， 获得的重组质粒pGEMTeasyBicc1N经限制性内切酶EcoR I、 Xho I酶切鉴定并测序， 测序结果经对比完全正确。回收pGEMTeasyBicc1N经EcoR I、 Xho I双切后的Bicc1N核酸片段， 连入经同样双酶切后的pGexHisC3载体， 获得原核表达载体pGex HisC3Bicc1N， 并经酶切和测序鉴定。

　　1.2.3 GSTBicc1N融合蛋白的诱导表达 将构建的原核表达重组质粒pGexHisC3Bicc1N转化到Rosetta cells中， 挑取单菌落接入含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中扩增， 次日以1∶20比例转接， 37℃摇至A600为0.5～0.6时， 加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG， 分别在25℃及37℃诱导培养5～7 h。离心收菌， 用1/10体积PBS（含PMSF）重悬菌体沉淀， 冰浴超声后， 12 000 r/min， 4℃离心15 min。取上清， 沉淀用等体积的新鲜配制的8 mol/L尿素溶解， 取5 μL行分离胶浓度为100 g/L的SDSPAGE电泳， 以未加IPTG诱导的细菌裂解产物为对照， 分别经考马斯亮蓝R250染色及Western blot分析融合蛋白的诱导表达情况， 选取可溶性融合蛋白表达较多的条件进行诱导。

　　1.2.4 融合蛋白的表达及纯化 诱导表达的菌液经超声处理后， 12 000 r/min， 4℃离心15 min取上清， 经SDSPAGE电泳， 0.2 mol/L氯化钾染胶， 根据相对分子质量(Mr)大小确定目的条带位置后切下相应条带， 将含有目的蛋白的胶条切碎并经DYCP43型蛋白质回收电泳槽50 V电泳8 h， 在正极小池中收集蛋白溶液。使用超滤离心管浓缩蛋白样品， BCA法蛋白定量并利用Western blot鉴定回收蛋白是否为目的蛋白。

　　1.2.5 GSTBicc1N兔多克隆抗血清的制备和纯化 初次免疫将1 mg融合蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混匀乳化后于背部皮下多点注射。之后每2周加强免疫1次， 免疫方式同上， 自此每周取血1次， 用于ELISA监测血清效价， 待效价稳定在1∶104以上时， 取全血并用重组蛋白G亲和层析柱纯化血清（纯化步骤见产品说明书）。

　　1.2.6 间接免疫荧光 预冷PBS清洗细胞爬片2遍， 40 g/L多聚甲醛于4℃固定30 min， 封闭液(10 g/L BSA3 mL/L Triton X100/PBS) 室温处理1 h， 加入一抗37℃反应1 h， PBST清洗3次， 再加入荧光标记的二抗室温反应1 h， PBST清洗3次， 浓度为1 mg/L的DAPI/PBS溶液染核， 750 mL/L的甘油/PBS(pH9.5)封片。2 结果

　　2.1 小鼠Bicc1基因的扩增和真核表达载体的构建 以小鼠肾脏总cDNA为模板， 以小鼠Bicc1基因的5′和3′末端序列为特异性引物扩增小鼠Bicc1（全长2 930 bp）， 可以在3 kb处得到1条清晰的条带（图1A）， 与预期条带大小相符; 将PCR产物连入pGEMTeasy载体经测序并与小鼠Bicc1基因序列进行比对， 发现该PCR产物即为小鼠Bicc1基因（图1B）。利用Sac I、 BamH I和Sca I酶切pGEMTeasyBicc1后将Bicc1基因片段亚克隆入真核表达载体pCMVTag4A中， 从而获得小鼠Bicc1基因的真核表达载体pCMVTag4ABicc1（图1C）。

　　2.2 小鼠Bicc1蛋白抗原区段的选择、 PCR扩增及原核表达载体的构建 SMART Tool分析结果显示小鼠Bicc1蛋白与其他物种的BicaudalC蛋白一样: N端含3个KH结构域， C端有1个SAM结构域， 未发现信号肽序列和跨膜区; 根据DNAStarProtean软件的分析结果取该蛋白N端61E199A（包含前2个KH结构域）这一段氨基酸序列为抗原区（Bicc1N)免疫动物制备兔抗Bicc1多克隆抗体（图2A）。

　　以pGEMTeasyBicc1载体为模板， PCR扩增Bicc1N。该抗原区段含有139个氨基酸， 对应的DNA为417 bp（图2B）。PCR产物连入pGEMTeasy载体后， 用EcoR I和Xho I酶切鉴定（图2C）， 并将Bicc1N片段连入经同样酶切的pGEXHisC3载体（图2D）。

　　2.3 GSTBicc1N融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化 在25℃和37℃诱导pGexHisC3Bicc1N/Rosetta细菌分别诱导5、 6、 7 h后收菌， 超声后产物经SDSPAGE电泳、 考马斯亮蓝染色， 显示在Mr 41 300处的可溶性部分和包涵体中均有目的蛋白条带， 与GSTBicc1N融合蛋白Mr 一致， 同时在未诱导全菌蛋白中则没有该条带（图3A）。将两种温度下诱导6 h的可溶性及包涵体部分蛋白作Western blot（一抗为GST mAb）检测， 都能在Mr 41 300处得到特异性条带， 证明该条带确实为目的蛋白， 且目的蛋白在25℃诱导条件下可溶性表达较好（图3B）。根据上述实验结果确定诱导条件为25℃以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h。

　　大量诱导并回收、 浓缩GSTBicc1N融合蛋白后， 经BCA法定量， 浓度达2.012 g/L， 行SDSPAGE电泳并考染， 可见清晰的单一考马斯亮蓝染色条带（Mr相符）（图3C1）; 同时用GST mAb做Western blot检测， 也得到大小一致的单一条带（图3C2）， 充分证明该回收蛋白为目的蛋白。

　　A: 不同诱导条件蛋白表达图; M: 蛋白marker; 1: 未诱导总菌体蛋白; 2， 4， 6: 分别是25℃诱导5， 6， 7 h 后上清液蛋白; 3， 5， 7: 分别是25℃诱导5， 6， 7 h后包涵体蛋白; 8～13: 37℃诱导表达产物， 顺序同上. B:Western blot鉴定诱导产物图; 1: 未诱导总菌体蛋白; 2， 4: 分别是25℃和37℃诱导6 h 后上清液蛋白; 3， 5: 分别25℃和37℃诱导6 h 后包涵体蛋白. C: 回收浓缩后Western blot鉴定图; M: 蛋白marker; 1， 2: 分别是浓缩蛋白GSTBicc1N上样后考染、 Western blot图， Mr相符.

　　2.4 小鼠Bicc1蛋白兔多抗血清的特异性鉴定 纯化的融合蛋白免疫动物后， 获得抗小鼠Bicc1蛋白的多抗血清mBicNp。将原核诱导表达的菌体裂解为样品， 分别用免疫前血清、 mBicNp、 GST mAb 做Western blot， 后两者能在相同的位置（Mr为41 300）获得惟一条带， 而免疫前血清没有检测到任何条带（图4A）， 初步证实了该多抗血清识别GSTBiccN。为进一步证实该抗体的特异性， 以真核表达载体pCMVTag4ABicc1转染人胚肾293细胞36 h后细胞总蛋白为样品， 分别用免疫前血清、 Flag mAb 和mBicNp 做Western blot， 后两者都能在Mr为110 000处得到惟一条带， 而免疫前血清未检测到任何条带， 充分证实该多抗可识别Bicc1蛋白; 纯化后多抗血清做Western blot 也能得到相同的结果（图4B）。

　　2.5 小鼠Bicc1蛋白细胞定位的初步研究 蛋白在细胞内的定位与其功能密切相关， 小鼠Bicc1蛋白在细胞内的定位尤其是在肾脏发育过程中的时空表达方式还未阐明。pCMVTag4ABicc1载体瞬转MDCK细胞36 h后做细胞爬片的间接免疫荧光实验， 分别以Flag mAb和纯化后mBicNp为一抗， 结果显示两者都能在胞质内检测到Bicc1蛋白的表达（图5B、 C）， 尤其在一些囊泡样的细胞器内表达较高， 而用免疫前血清没有检测到任何荧光（图5A）; 用纯化后mBicNp和Flag mAb同时做一抗， 也能在胞质内得到完全重叠的荧光（图5D、 E、 F）。这些结果一方面提示Bicc1蛋白主要分布于细胞质内， 另一方面说明纯化后兔多抗mBicNp有高度的特异性。

　　3 讨论

　　在较低等的生物如线虫和果蝇中， BicaudalC与胚胎发育密切相关， 而在较高等的生物如小鼠， 该基因则参与了部分器官尤其是肾脏的正常形成［6］。在线虫中， GLD3可与GLD2形成复合体激活GLD1的表达， 从而调控细胞从有丝分裂转向减数分裂。Chicoine等通过制备果蝇BicaudalC蛋白的抗体并利用免疫沉淀的方法从果蝇卵中分离了BicaudalC特异结合的RNA， 其中包括BicaudalC自身mRNA和一些参与卵发生及细胞骨架调控的基因mRNA［11］。小鼠BicaudalC基因突变与多囊肾的形成密切相关， 例如jcpk（juvenile congenital polycystic kidney disease）纯合子小鼠模型的Bicc1基因在3号外显子上的一个碱基发生突变（G→A）， 导致3号外显子缺失并在4号外显子中提前产生终止密码子， 其蛋白质产物Bicc1jcpk只有93个氨基酸， 缺失了KH1的大部分及Kh3、 KH3和SAM结构域［7］。最近Bouvrette等的研究发现， 小鼠Bicc1蛋白在体外能够与RNA结合， 其KH3结构域对于RNA的结合是必需的， 因此Bicc1jcpk蛋白在体外无法与RNA结合［2］。人类常染色体显性多囊肾和隐性多囊肾的致病基因产物都在纤毛和中心粒内有分布， 这些蛋白的缺失将导致纤毛异常并引起多囊肾， 因而多囊肾的发生与纤毛缺陷密切相关［8］。我们的免疫荧光结果表明， Bicc1蛋白并未集中在纤毛或中心粒内， 而是广泛分布于胞质内并在一些囊泡样的结构内表达较高。Bicc1蛋白是高度保守的双尾C蛋白家族成员， 提示Bicc1可能是通过KH、 SAM结构域与其他蛋白或RNA形成复合体， 在转录后水平调控相应基因的表达， 从而在肾脏发育和功能发挥中起着至关重要的作用。

　　我们克隆了小鼠的全长Bicc1基因并首次制备了Bicc1蛋白的多克隆抗体， 免疫荧光结果表明制备的多抗具有高度特异性， 以期利用该抗体寻找与Bicc1蛋白特异相互作用的mRNA和蛋白质， 从而有可能揭示肾发育等过程的调控机制和多囊肾的发病机制。

参考文献

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