重症肌无力CD45RA、 CD45RO胸腺细胞亚群及相关细胞因子表达分析

　　　　 作者：李倩如， 杜英， 赵航， 高峰， 张清勇， 张钦宪

【摘要】 目的: 探讨胸腺细胞异常分化与重症肌无力发生的关系。方法: 采用基因芯片对多种白细胞介素、 干扰素及其受体mRNA表达进行分析， 采用流式细胞术测定胸腺细胞CD45RA、 CD45RO的表达率， 采用免疫组化对胸腺组织切片CD45RA、 CD45RO表达及分布进行检测。结果: MG患者IL1R、 IL4R、 IFNγR1、 IFNγR2、 IL6、 IL8表达水平显著低于对照组; IL10RB表达水平显著高于对照组; IL1、 IL2、 IL4、 IL10、 IL7、 IFNα、 IFNβ、 IFNγ表达水平在MG和对照组均很低， 无显著差异; MG患者CD56+胸腺细胞百分率（0.56±0.33）显著低于对照组（1.78±0.69）， MG患者CD45RO+、 CD1a+细胞显著高于对照组。免疫组化和RTPCR也有相同结果。结论: MG患者胸腺细胞发育过程中CD45RO+细胞向CD45RA+T细胞转变存在异常。

【关键词】 白细胞介素; CD45RA; CD45RO; 重症肌无力; 胸腺

　　重症肌无力（myasthynia gravis， MG）是有显著胸腺异常和T细胞功能异常的自身免疫性疾病。胸腺是T细胞发育成熟的场所， 胸腺细胞的发育受胸腺微环境中胸腺基质细胞、 胸腺激素和细胞因子的影响， 经历TCR基因重排、 CD4和CD8分子双阴性、 双阳性、 到单阳性细胞阶段， 使T细胞由不成熟到成熟， 并获得MHC限制性和自身耐受性。以往已有研究表明MG患者胸腺组织双阳性细胞（CD4+CD8+）、 单阳性细胞（CD4+CD8-， CD4-CD8+）及细胞凋亡分子（CD95）表达均存在异常， MG胸腺组织可见生发中心， 可检测到自身抗体（AchRab）［1-3］。但MG患者胸腺结构和功能异常的机制至今尚不清楚。但对CD45RA、 CD45RO、 CD56、 CD1a分子表达的报道较少。为深入探讨不同胸腺细胞亚群在MG发生中的作用， 我们对MG患者胸腺细胞多种表面标志、 细胞因子及其受体进行了分析。

1 材料和方法

　　1.1 材料 研究对象为临床确诊并行手术切除胸腺的MG患者， 选择胸腺增生型MG患者37例为实验组， 男20例， 女17例; 年龄6～53 (26. 66 ±16. 29)岁。对照组为非自身免疫先天性心脏病患者， 共16例， 年龄4～45 (25. 37 ±12.32)岁。TRzol试剂为Invitrogen产品， FACScan 流式细胞仪为美国BD公司产品。FITC标记小鼠抗人CD56、 CD45RA、 CD45RO 单克隆抗体（mAb）， PE标记小鼠抗人CD1a、 HLADR mAb 及FITC、 PE标记同型免疫球蛋白IgG1FITC、 IgG2PE， 均购自美国Farmingen 公司。小鼠抗人CD3、 CD56、 HLADR mAb购自北京中杉公司。小鼠抗人CD25、 CD161、 CD45RO、 CD45RA mAb购自美国eBioscience公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 胸腺组织RNA提取 100 mg左右新鲜胸腺组织立即置于液氮， 加入1 mL TRIzol试剂， 用匀浆器进行匀浆， 依次加入0.2 mL的氯仿， 4℃ 12 000 g离心15 min， 吸取上层水相， 加入0.5 mL的异丙醇， 混匀， 室温孵育10 min， 4℃ 12 000 g离心10 mn， 获得RNA。电泳鉴定RNA质量。-70℃保存。

　　1.2.2 基因芯片分析白细胞介素、 干扰素及其受体mRNA表达 将胸腺组织匀浆分别采用TrueLabelingAMPTM线性RNA扩增试剂盒、 SuperArray ArrayGrade cRNA 纯化试剂盒进行cDNA合成、 cRNA合成和cRNA纯化， 采用Oligo GEArray芯片依次进行预杂交、 杂交、 洗膜， 采用化学发光检测试剂盒(SuperArray Bioscience， Catalog Number D01)进行化学发光检测， 采用GEArray Expression Analysis Suite进行芯片数据分析。

　　1.2.3 流式细胞术分析胸腺细胞表面标志 无菌取1 g左右胸腺组织， 去筋膜、 血污后， 剪碎， 在100目不锈钢网上轻柔研磨， 过200目无菌不锈钢网， 制成单细胞悬液， 经淋巴细胞分离液2 000 r/min， 15 min离心分离出胸腺细胞。用PBS洗细胞2次， 调整细胞密度至109个细胞/L， 台盼蓝计数活细胞&>95%。取100 μL细胞悬液分别用CD4FITC、 CD8PE、 CD56FITC、 CD95PE、 CD1aPE、 HLADRPE、 CD45RAFITC、 CD45ROPE进行双标记或单标记， 另以未加抗体作阴性对照、 荧光标记的同型抗体作同型对照， 避光、 4℃、 孵育30 min， PBS漂洗2次， 悬浮细胞至200 μL上机检测。

　　1.2.4 胸腺组织的免疫组化分析 取1 g左右胸腺组织放入40 g/L多聚甲醛溶液固定， 将胸腺组织经石蜡包埋、 切片。按免疫组化染色试剂盒(SP法北京中杉公司提供)说明书操作。进行CD3、 CD45RO、 CD45RA、 CD56和HLADR抗原检测。DAB显色剂显色。

　　1.2.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件对计数资料行χ2检验， 计量资料行t检验。

　　2 结果

　　2.1 MG患者胸腺组织ILs、 IFN及其受体mRNA的表达 分别对MG患者和对照组胸腺组织进行多种ILs、 IFNs及其受体进行检测， 如图1。结果显示， MG患者IL1R、 IL4R、 IFNγR1、 IFNγR2、 IL6、 IL8表达水平显著低于对照组; MG患者胸腺IL10RB表达水平显著高于对照组; IL1、 IL2、 IL4、 IL7、 IL10、 IL17、 IFNα、 IFNβ及其受体、 IFNγ表达水平在MG和对照组均很低， 无统计学意义。

　　2.2 MG患者及对照组胸腺细胞CD45RA、 CD45RO、 CD56、 CD1a分子表达 结果显示， MG患者胸腺细胞CD45RA+、 CD56+细胞明显减少（P&<0.01）; CD45RO+、 CD1a+细胞显著高于对照组（P&<0.01， 表1）。表1 MG患者及对照组胸腺细胞CD45RA、 CD45RO分子及CD56、 CD1a分子表达

　　2.3 MG患者与对照组胸腺免疫组化结果比较 在MG患者和对照组胸腺组织CD45RA、 CD56分子均呈弱阳性表达( 图2A); MG患者和对照组的显著区别在CD45RO分子的表达， 前者呈强阳性表达， 且表现为灶状分布（图2B）。

　　3 讨论

　　CD45RA和CD45RO是CD45分子的两种异型， 属I型跨膜蛋白， 是区分初始T细胞和记忆T细胞的标志。在外周血中， CD4+CD45RA+ T细胞为初始T细胞， 接触抗原活化后可转变为CD4+CD45RO+ T细胞。CD4+CD45RO+ T细胞为记忆T细胞， 再次接触抗原可迅速增殖， 具有较强辅助B 细胞合成IgG的能力。有研究报道， T细胞在胸腺发育过程中也存在CD45RA/CD45RO转换， 由CD45RO+转换为CD45RA+可能标志着阴性选择的完成［4］， 胸腺细胞的阴性选择是排除自身反应性T细胞、 防止自身免疫性疾病发生的关键环节， 亦即CD45RO+向CD45RA+的转换可能与自身反应性T细胞的排除有关。本研究显示， MG患者胸腺细胞CD45RA表达明显减少， CD45RO分子表达明显增高， 在免疫组化染色中可见MG患者CD45RO分子表达呈灶状分布， 提示MG患者T细胞在胸腺发育过程中存在CD45RO到CD45RA的转变障碍， 并因此不能完成阴性选择过程， 从而与自身免疫性MG的发生有关。

　　我们对多种细胞因子及其受体mRNA进行检测， 仅发现MG患者胸腺组织IL6和IL8 mRNA表达明显低于非自身免疫病对照组， 其他Th1、 Th3、 Th17型细胞因子在MG患者和对照组均表达低下。细胞因子的检测结果说明MG患者胸腺组织不存在Th细胞的异常活化， 因此CD45RO+T细胞数量增多可能不是由于T细胞活化后分化为记忆细胞的结果， 而是由于胸腺细胞发育过程中CD45RO+向CD45RA+的转变障碍。

　　我们在研究中还发现， IL1R1、 IL1R2、 IL1RN、 IL4R、 IFNγR2 mRNA表达明显低于对照组， 说明MG患者胸腺细胞对IL1、 IFNγ反应性低下; 而IL6、 IL8 mRNA明显低于对照组， 说明MG患者胸腺细胞和胸腺基质细胞分泌IL6、 IL8能力降低， 导致MG患者对正常T细胞的促增殖能力和对T细胞的趋化能力降低; 研究中显示MG患者胸腺IL10RB表达水平明显高于对照组， 说明MG患者胸腺细胞对IL10的抑制作用敏感性增强。这些因素可能也与CD45RO+细胞向CD45RA+T细胞转变障碍有关。

参考文献

［1］ Utsugisawa K， Nagane Y， Suzuki S， et al. Antigenspecific Tcell activation in hyperplastic thymus in myasthenia gravis［J］. Muscle Nerve， 2007， 36(1): 100-103.

［2］ Aruna BV， Sela M， Mozes E. Downregulation of T cell responses to AchR and reversal of EAMG manifestations in mice by a dual altered peptide ligand via induction of CD4+CD25+ regulatory cells［J］. Neuroimmunol， 2006， 177(1-2): 63-75.

［3］ Tackenberg B， Kruth J， Bartholomaeus JE， et al. Clonal expansions of CD4+ B helper T cells in autoimmune myasthenia gravis［J］. Eur J Immunol， 2007， 37(3): 849-863.

［4］ Hoffmann P， Eder R， Boeld TJ， et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T cell lines upon in vitro expansion［J］. Blood， 2006， 108(13): 4260-4267.