血管紧张素Ⅱ诱导RAW264.7细胞Toll样受体4表达及髓过氧化物酶活性的机制研究

　　　　作者：姬媛媛， 王志东， 刘俊田， 刘娜

【摘要】 目的: 探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对RAW264.7细胞Toll样受体4(TLR4)mRNA、 蛋白表达及髓过氧化物酶(MPO)活性的影响及其致炎致动脉粥样硬化(AS)机制。方法: 体外培养RAW264.7细胞， 用不同浓度的AngⅡ(1、 10、 100、 1000 nmol/L)及100 μg/L脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞24 h后， RTPCR法测RAW264.7细胞TLR4 mRNA水平， Western blot检测RAW264.7细胞TLR4蛋白表达， 比色法测细胞培养上清中MPO活性。同时， 预先加入不同剂量的TLR4阻断剂(1 mg/L、 5 mg/L)后， 再用AngⅡ(100 nmol/L)刺激RAW264.7细胞24 h， 检测细胞培养上清中MPO活性。结果: AngⅡ浓度依赖性地增加RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白表达(P&<0.01)， LPS也可诱导RAW264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白表达(P&<0.01); AngⅡ浓度依赖性地升高RAW264.7细胞MPO活性(P&<0.01)， LPS也可升高RAW264.7细胞MPO活性(P&<0.01)， 而TLR4阻断剂明显抑制AngⅡ这一效应(P&<0.01)。结论: AngⅡ上调RAW264.7细胞TLR4表达， 通过跨膜受体TLR4诱导MPO分泌， 加重炎症反应， 促进AS的形成和发展。

【关键词】 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ); RAW264.7细胞; TLR4; 髓过氧化物(MPO)

　　动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)是缺血性心脑血管病的病理基础， 发病机制未完全清楚， 目前认为属慢性炎症性或自身免疫性疾病。Toll样受体( toll like receptors， TLRs) 是一类重要的模式识别受体［1］， 特别是TLR4， 作为新的炎症信号传递门户蛋白， 是免疫反应、 慢性炎症和脂代谢紊乱间的桥梁， 激活TLR4可引起慢性炎症反应， 参与AS的形成［2］。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ， AngⅡ)的致AS作用与致炎密切相关， 但致炎效应与TLR4之间的关系尚不清楚。因此， 本实验在体外观察AngⅡ对RAW264.7细胞TLR4蛋白和mRNA表达及髓过氧化物(myeloperoxidase， MPO)活性的影响， 探讨TLR4是否介导AngⅡ的致炎及致AS作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自中国科学院上海细胞研究所， RPMI1640培养基及胎牛血清(FBS)购自Gibco公司， AngⅡ及脂多糖(LPS)购自Sigma公司。TRIzol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司， 逆转录试剂盒购自Fermentas公司， Premix Taq酶购自大连宝生物工程有限公司， PCR引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。RIPA裂解液购自北京百泰克生物技术有限公司， 蛋白酶抑制剂(Cocktail)购自Roche公司， NC膜购自Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒、 增强化学荧光试剂ECL由美国Pierce公司提供。兔抗TLR4多克隆抗体购自Santa Crutz公司， 羊抗兔IgGHRP抗体购自晶美生物公司， TLR4阻断剂(functional grade purified antimouse Tolllike receptor 4)购自eBioscience公司。MPO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。752C紫外可见分光光度计为上海第三分析仪器厂产品， RCP扩增仪为美国ABI公司产品， 垂直电泳转膜装置及凝胶扫描成像系统为美国BIORAD公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 RAW264.7细胞密度为1×109/L， 用RPMI1640完全培养液(100 mL/L FBS ， 100 万U/L青霉素及100 mg/L链霉素) 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养细胞， 每2～3 d传代1次， 取对数生长期细胞用于实验。

　　1.2.2 细胞处理 取对数生长期细胞， 调整细胞的密度为5×109/L， 接种于6孔板， 2 mL/孔。18～20 h换含5 mL/L FBS的RPMI1640培养液， 继续培养20～24 h使细胞同步化后， 以不同浓度的AngⅡ(1、 10、 100、 1 000 nmol/L)及LPS(100 μg/L)刺激24 h后收集上清液， 同时收集细胞提取总蛋白和RNA; 另外一组在细胞同步化后， 预先1 h加入不同浓度TLR4阻断剂(1 mg/L、 5 mg/L)， 再加AngⅡ(100 nmol/L)刺激24 h后收集上清液。

　　1.2.3 RTPCR检测细胞TLR4 mRNA水平 按TRIzol试剂盒说明书操作提取总RNA， 用紫外分光光度计进行浓度及纯度测定， -70℃保存。取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA， 具体按逆转录试剂盒说明操作， 再取逆转录产物2 μL进行PCR循环。目的基因TLR4引物序列: 上游5′GGCATCATCTTCATTGTCCTTG3′， 下游5′AGCATTGTCCTCCCACTCG3′， 扩增片段为111 bp。内参βactin引物序列: 上游5′ATCGGCAATGAGCGGTTCC3′， 下游5′AGCACTGTGTTGGCATAGAGG3′， 扩增片段为149 bp。PCR反应条件: 预变性94℃ 3 min， 94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 最后72℃终止5 min， 共35个循环。重复3次独立的RTPCR全过程。取PCR产物5 μL上样于15 g/L琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)， 80 V电泳25 min， 凝胶图像分析系统扫描摄图， 并分析目的基因TLR4及内参βactin基因灰度值， 计算两者的比值， 即得TLR4 mRNA水平， 结果表示为: (各组TLR4 mRNA水平/正常对照组TLR4 mRNA水平)×100%。

　　1.2.4 Western blot检测细胞TLR4蛋白表达 弃去培养液， 用冷PBS轻轻漂洗1遍后， 随即加入冷细胞裂解液以裂解细胞。刮下细胞， 置于Eppedorf管， 并用破膜仪反复抽打细胞3次以剪切细胞内核酸， 使蛋白充分溶出。静置于冰上20 min以沉淀蛋白， 再以12 000 r/min、 4℃离心15 min， 取上清液并移至另一Eppedorf管中， 加入1/4体积的5×上样缓冲液， 随后煮沸10 min， 放于-20℃保存。蛋白定量按照试剂盒说明进行。蛋白上样量为20 μg ， SDSPAGE电泳分离蛋白， 采用半干式电转移法， 将蛋白质转移到NC膜上。封闭液封闭2 h， 按1∶200加入兔抗小鼠TLR4一抗， 4℃孵育过夜， TBST冲洗3×15 min， 按1∶5 000 加入HRP标记羊抗兔二抗， 室温孵育1 h， TBST冲洗3×15 min， 用ECL显色并曝光于X 胶片， 并用凝胶图像分析系统对胶片进行扫描分析和拍照。结果表示为: (各组TLR4蛋白表达量/正常对照组TLR4蛋白表达量)×100%。

　　1.2.5 细胞上清液MPO活性的测定 将收集的细胞上清液用浓缩滤器浓缩约1/20， 采用比色法测定上清液MPO活性， 具体步骤按照MPO试剂盒说明进行。

　　1.2.6 统计学分析 数据以x±s表示， 用SPSS10.0统计软件进行分析， 多组比较用ANOVA单因素方差分析， 组间两两比较采用学生t检验。P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 AngⅡ和LPS对RAW264.7细胞TLR4 mRNA水平的影响 不同浓度的AngⅡ刺激RAW264.7细胞24 h后， TLR4 mRNA水平随着AngⅡ浓度的增高而升高， 呈浓度依赖性(P&<0.01， 图1)。阳性对照组用100 μg/L LPS刺激RAW264.7细胞24 h后， TLR4 mRNA水平也明显升高(P&<0.01)。

　　图1 AngⅡ和LPS对RAW264.7细胞TLR4mRNA水平的影响

　　Fig 1 Effect of AngⅡand LPS on TLR4 mRNA levels in RAW264.7 cells

　　bP&<0.01 vs control group.

　　2.2 AngⅡ和LPS对RAW264.7细胞TLR4蛋白表达的影响 图2结果表明， 不同浓度的Ang Ⅱ刺激RAW264.7细胞24 h后， TLR4蛋白表达随着Ang Ⅱ浓度的增高而增加， 呈浓度依赖性(P&<0.01)。阳性对照组用100 μg/L LPS刺激RAW264.7细胞24 h后， TLR4蛋白表达也明显增加(P&<0.01)。图2 AngⅡ和LPS对RAW264.7细胞TLR4蛋白表达的影响

　　2.3 AngⅡ和LPS对RAW264.7细胞MPO活性影响 图3结果显示， 正常情况下RAW264.7细胞MPO活性较低。不同浓度AngⅡ刺激RAW264.7细胞24 h后， 细胞MPO活性升高， 且呈浓度依赖性(P&<0.01)， 同时100 μg/L LPS也能升高RAW264.7细胞MPO活性 (P&<0.01)。

　　2.4 TLR4阻断剂对AngⅡ诱导的RAW264.7细胞MPO活性的影响 AngⅡ刺激24 h后， 与未阻断组比较， TLR4阻断剂的2个剂量对AngⅡ诱导的RAW264.7细胞MPO活性均有显著地抑制作用(P&<0.01)。结果表明， AngⅡ可能通过TLR4影响RAW264.7细胞MPO活性(图4)。

　　3 讨论

　　TLR4是TLRs家族中的重要成员， 可能在AS的发生发展中起重要作用。TLR4主要存在于巨噬细胞、 中性粒细胞以及树突状细胞表面， 可接受外源性配体LPS的刺激而活化， 进而通过一系列胞内信号转导过程， 最终使转录因子NFκB活化， 启动多种与炎症反应相关的基因转录［3］。LPS也可通过TLR4图4 AngⅡ通过TLR4影响RAW264.7细胞MPO活性刺激免疫细胞在体内引起一个持续的慢性炎症过程， 促进AS的形成［4］。有研究证实， 在人AS斑块的巨噬细胞上TLR4表达增加， 氧化LDL能上调体外培养的巨噬细胞TLR4表达， 提示TLR4在脂质介导的促炎症反应中发挥作用［5］。此外， TLR4激动能够增加单核细胞趋动蛋白1(MCP1)和其他趋化因子表达， 从而参与单核细胞聚集并启动炎症反应［6］。本研究显示， 随着AngⅡ刺激浓度的依次增高， RAW264.7细胞TLR4 mRNA水平逐渐升高， TLR4蛋白表达也逐渐增加; 同时， LPS也可促进TLR4在RAW264.7细胞中的表达， 这说明除外源性配体LPS外， AngⅡ也可通过TLR4引发巨噬细胞炎症反应， 参与AS的发生发展。

　　AngⅡ是肾素血管紧张素系统的主要活性物质， 通过诱导MCP1的产生， 使其在组织器官局部募集、 活化单核巨噬细胞， 启动炎症反应， 引发AS［7］。MPO是由巨噬细胞分泌的含血红素辅基的一种酶， 它催化底物过氧化氢和氯离子生成产物次氯酸参与炎症反应的氧化吸收过程。以往MPO仅被看作是一种杀微生物的酶， 但现已发现它与AS斑块的稳定性有相当密切的关系， 并把它作为冠状动脉粥样硬化易损斑块一种新的预警标志物［8， 9］。我们以具有巨噬细胞特征的小鼠RAW264.7细胞株为研究对象， 通过观察AngⅡ和LPS诱导其MPO释放， 可能会更好地反映MPO在炎症反应中的作用。结果表明， 随着AngⅡ刺激浓度的依次增高， RAW264.7细胞MPO活性也逐渐升高， 进而说明AngⅡ激活后的巨噬细胞可释放出大量的MPO， 从而产生氧化、 促炎及促AS的作用， 影响粥样斑块的稳定性。尽管本实验已证明AngⅡ刺激RAW264.7细胞， 促进MPO的分泌， 启动炎症反应， 但TLR4是否可以介导此效应尚不清楚。因此， 我们预先给予RAW264.7细胞不同剂量的TLR4阻断剂后， 再用AngⅡ刺激， 结果发现RAW264.7细胞MPO活性显著降低， 结合TLR4的外源性配体LPS也可使RAW264.7细胞MPO活性升高， 通过正反两方面进一步证实TLR4可能介导了AngⅡ刺激的RAW264.7细胞分泌MPO， 诱发炎症反应， 促进AS的进程。

　　综上所述， AngⅡ通过上调巨噬细胞TLR4 mRNA及蛋白表达， 同时促使MPO分泌， 启动炎症反应。此外， AngⅡ可能通过跨膜受体TLR4， 激活胞内信号转导途径， 诱导MPO分泌， 加重炎症反应， 促进AS形成和发展。

参考文献

［1］ Medzhitov R， PrestonHurlburt P， Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］. Nature， 1997， 388(6640): 394-397.

［2］ 王笑梅， 司良毅. Toll受体与动脉粥样硬化的关系研究进展［J］. 第三军医大学学报， 2005， 27(10): 1055-1056.

［3］ 张 罕， 吕 喆， 李冬妹， 等. 实时定量PCR分析小鼠树突状细胞TLR4mRNA表达及地塞米松的调节［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2008， 24(3): 221-224.

［4］ Kaisho T， Akira S. Tolllike receptors as adjuvant receptors［J］. Biochim Biophys Acta， 2002， 1589(1): 1-13.

［5］ Xu XH， Shah PK， Faure E， et al. Toll like receptor 4 is expressed by macrophages in murine and human lipid rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized LDL［J］. Circulation， 2001， 104(25): 3103-3108.

［6］ Vink A， Schoneveld AH， van der Meer JJ， et al. In vivo evidence for a role of tolllike receptor 4 in the development of intimal lesions［J］. Circulation， 2002， 106(15): 1985-1990.

［7］ Luft FC， Mervaala E， Muller DN， et al. Hypertensioninduced endorgan damage: A new transgenic approach to an old problem［J］. Hypertension， 1999， 33(1 pt 2): 212-218.

［8］ Zhang R， Brennan ML， Fu X， et al. Association between myeloperoxidase levels and risk of coronary artery disease［J］. JAMA， 2001， 286(17): 2136-2142.

［9］ Koenig W， Khuseyinova N. Biomarkers of atherosclerotic plaque instability and rupture［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2007， 27(1): 15-26.