急性冠脉综合征患者CD4+CD28-T淋巴细胞与HLADRB1的相关性

　　　　　　作者：黄立娟， 李璐璐， 宋辉， 杜波

【摘要】 目的: 探讨人 HLADRB1等位基因多态性与急性冠脉综合征（ACS）CD4+CD28- T细胞数量的关系。方法: 采用聚合酶链反应序列特异性引物DNA分型技术对136例ACS患者和115例健康对照进行HLADRB1基因分型。同时采用流式细胞术（FCM）进行CD4+CD28- T 细胞测定， 分析HLA与CD4+CD28- T 细胞的相关性。结果: HLA DRB1*15， DRB1*04和DRB1*01等位基因与CD4+CD28- T淋巴细胞数量相关， 表达DRB1*04和DRB1*01的患者有高百分比的CD4+CD28-T淋巴细胞， 而表达DRB1*15的所有患者却有低数量的CD4+CD28- T淋巴细胞。结论: 在黑龙江地区人群中， ACS患者CD4+CD28- T细胞的形成与HLADRB1*01、 DRB1*04和DRB1*15 密切相关。

【关键词】 急性冠脉综合征; CD4+CD28- T淋巴细胞; 人白细胞抗原

　　大量文献研究表明免疫与炎症参与了动脉粥样硬化的形成及发展， 尤其是T细胞免疫在冠心病发生发展中的作用已成为目前研究的热点。研究发现急性冠脉综合征ACS患者外周血出现CD4+CD28- T细胞增多的现象， 推测这种细胞的出现可能是受遗传控制的［1］。此前研究还发现在类风湿性关节炎患者CD4+CD28- T细胞的出现与HLADR等位基因相关联［1］。因此可以这样设想ACS患者中的CD4+CD28- T细胞增多可能与HLA有关。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 PCRSSP分型试剂盒（中国医学科学院基础所）; PCR扩增仪（美国BioRad公司， My CyclerTM）; 电泳系统 （美国BioRad公司， MiniProteinII电泳系统）; 凝胶成像系统（上海天能科技有限公司， GIS）; 流式细胞仪( 美国BD公司)、 PerCPCD3单克隆抗体（mAb）， FITCCD mAb， PECD28 mAb， PE鼠IgG1， PerCP鼠IgG1， FITC鼠IgG1和10×FACS溶血素（美国BD公司）; PBS和10 g/L多聚甲醛为实验室自行配制。所有标本均来自哈尔滨医科大学附属第二医院住院患者。分组（1）ACS组: 136例， 男72例， 女64例; 平均年龄52.3±13.1岁。ACS的诊断符合1979年国际心脏病学会和协会及世界卫生组织(ISFC/WHO)的诊断标准。（2）对照组: 115名同地区无血缘关系健康人， 男60名， 女55名， 年龄38～55岁， 无冠状动脉疾病病史。所有标本用50 g/L EDTA抗凝管抽取清晨空腹静脉血3～5 mL， -20℃冻存备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA制备 参考《分子克隆实验指南》（第3版）: 哺乳动物DNA的快速分离。

　　1.2.2 PCRSSP法进行HLADR分型 （1）取已消毒的0.5 mL Eppendorf离心管， 依次标记DRB1DRB10、 DRB51DRB53共17管和DQB1*0201DQB1*0604共10管， 在25 μL/管的反应体系中， 依次加入下列各组分: ①引物4 μL。②扩增反应液20 μL（含dNTP， 内对照， 缓冲液， Taq酶5单位）。③待检DNA（0.05～0.1) g/L 1 μL。（2）混匀反应体系， 1 000 r/min离心30 s。（3） PCR扩增 : 94℃预变性120 s， 然后按如下程序扩增: 94℃变性40 s， 54℃退火45 s， 72℃延伸40 s， 循环30次。再于72℃延伸300 s。所有扩增均在美国BioRad公司扩增仪上进行。

　　1.2.3 扩增产物的检测 取扩增产物5 μL， 与1 μL上样缓冲液混匀后， 加样于20 g/L的琼脂糖凝胶中， 水平电泳检测， 在美国BioRad公司电泳仪及配套电泳槽上电泳， 电压100 V， 约20 min。于全自动凝胶成像分析系统记录结果进行分析。

　　1.2.4 CD4+CD28- T细胞频率测定 （1）实验设实试管和对照管。试验管和对照管分别加入新鲜全血100 μL。（2）实验管加入20 μL CD3PerCP mAb， PECD4 mAb和FITC CD28 mAb， 对照管加入20 μL PE鼠IgG1、 PerCP鼠IgG1和FITC鼠IgG1， 混匀， 室温避光孵育30 min。加入红细胞裂解液裂解红细胞， 离心5 min弃上清。（3）PBS洗涤。1 000 r/min离心5 min， 弃上清。用10 g/L多聚甲醛PBS固定10 min。（4）用流式细胞术分析CD4+CD28- T 细胞的百分比。

　　1.2.5 统计学分析 采用SPSS统计软件包， 结果用x±s表示， 组间均值比较采用t检验， P&<0.05时有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 ACS患者HLADRB1分型 ACS患者HLADRB1分型代表性结果见图1。每个泳道都有1条430 bp条带， 为内对照; 阳性带为第5、 7泳道， 分别为213 bp的DRB1*04和110 bp的DRB1*12条带。此患者基因型为DRB1*04/12 。

　　2.2 ACS患者CD4+CD28-T淋巴细胞百分比与HLADRB1的相关性 为研究CD4+CD28null T淋巴细胞的产生是否与MHCII等位基因有关， 我们研究了136例进行HLADRB1分型的ACS患者CD4+CD28- T淋巴细胞的频率。结果发现CD4+CD28- T细胞的数量与HLADRB*01、 DRB*04和DRB1*15有关（表1）。所有患者中HLADR*15阳性的患者CD4+CD28null T淋巴细胞百分比很低， 均值为2.8%， 明显低于总体均值5.9%（P&<0.05）。HLADRB1*15阴性的患者CD4+CD28- T淋巴细胞百分比明显增加。DRB1*04和DRB1*01阳性而DRB1*15阴性的患者CD4+CD28- T淋巴细胞百分比明显高于总体均值（P&<0.05）。而且DRB1*04阳性组和DRB1*15阴性组相比， 其CD4+CD28- T淋巴细胞百分比亦有显著性的差异（P&<0.01）。此外DRB1*01组与DRB1*15阴性组相比， 其CD4+CD28null T淋巴细胞百分比也有显著性的差异（P&<0.05）。 表1 ACS组HLADRB1各等位基因CD4+CD28- T细胞的数量aP&<0.05， bP &<0.01 vs所有患者CD4+CD28- T细胞均值.

　　3 讨论

　　ACS 是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或侵蚀， 继发完全或不完全闭塞性血栓形成的一组临床综合征。近年研究发现免疫细胞和炎症参与了ACS的发病过程。炎症细胞聚集在动脉损害处， 可能引起粥样斑块的不稳定而破裂［2］。研究证实了浸润冠状动脉斑块的T淋巴细胞是CD4+CD28- T细胞， 它缺乏CD28的表达， 并认为CD4+CD28- T细胞在ACS患者斑块破裂中可能具有直接的作用［3］。这种CD4+CD28- T细胞在正常人外周血中极罕见， 而在类风湿性关节炎或胰岛素依赖型糖尿病患者中该细胞增多［4］。但是直到目前为止ACS患者CD4+ T细胞缺乏CD28的表达的机制还不十分明确。

　　研究发现在冠心病中， ACS患者外周血CD4+CD28- T淋巴细胞较慢性稳定心绞痛患者明显增多［5］。那么这种细胞在ACS患者中的数量变化以及这种变化与MHCII等位基因是否相关还不清楚。为此我们研究136例进行HLADRB1分型的ACS患者CD4+CD28- T淋巴细胞的频率。发现在ACS患者中， DRB1*04和DRB1*01与CD4+CD28- T淋巴细胞的数量增加有关， 相反， DRB*15与CD4+CD28- T淋巴细胞数量减低有关。可见， ACS患者外周血CD4+CD28- T淋巴细胞百分比变化很大， 这说明ACS患者外周血CD4+CD28null T淋巴细胞增加与HLAII类等位基因的表达密切相关。国内的研究表明DRB1*04和DRB1*01是冠心病的易感基因［6］。而我们的研究显示DRB1*04和DRB1*01与CD4+CD28- T淋巴细胞数量增加有关， 这个结果更进一步说明HLA等位基因与冠心病的发病密切相关。本研究显示DRB1*15与CD4+CD28- T淋巴细胞数量减低有关， 即可以理解为有DRB1*15等位基因表达的个体不产生CD4+CD28null T淋巴细胞或产生的很少， 也就是说DRB1*15可能是ACS的保护性基因。这个结果因本研究病例数尚少， 有待于今后进一步研究证实。以上结果表明DRB1*04和DRB1*01作为冠心病的易感基因， 可能通过某种机制影响CD4+CD28null T淋巴细胞的产生， 参与冠心病的发病机制。总之， ACS患者CD4+CD28- T淋巴细胞形成与HLA的相关性研究对ACS防治具有重要的指导意义。

参考文献

［1］ Zal B， Kaski JC， Arno G， et al. HeatShock Protein 60reactive CD4+CD28-T cells in patients with acute coronary syndromes［J］. Circulation， 2004， 109(10): 1230-1235.

［2］ Wick G， Knoflach M， Xu Q. Autoimmune and Inflammatory Mechanisms in Atherosclerosis［J］. Annu Rev Immunol， 2004， 22: 361-403.

［3］ Nakajima T， Schulte S， Warrington KJ， et al. Tcellmediated lysis of endothelial cells in acute coronary syndromes［J］. Circulation， 2002， 105(5): 570-575.

［4］ Namekawa T， Snyder MR， Yen JH， et al. Killer cell activating receptors function as costimulatory molecules on CD4+CD28null T cells clonally expanded in rheumatoid arthritis［J］. J Immun， 2000， 165(2): 1138-1145.

［5］ Modulation of CD4+CD28null T lymphocytes by tumor necrosis factorα blockade in patients with unstable angina［J］. Circulation， 2006， 113(19): 2272-2277.

［6］ 黄立娟， 崔 颖， 刘 伟. 人白细胞抗原HLADRB1、 DQB1等位基因与冠心病的相关性研究［J］. 中华检验医学杂志， 2004， 27(10): 677.