醛脱氢酶8A1融合蛋白的表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

　　 作者：刘佳莹， 李淑珍， 李晓玲， 刘莹， 柳晓兰， 高建恩， 仲飞， 孙启鸿

【摘要】 　　目的: 重组表达醛脱氢酶8A1（aldehyde dehydrogenase 8 family member A1， ALDH8A1）蛋白， 制备其多克隆抗体， 并进行抗体的特异性鉴定， 以及蛋白在组织和细胞内的定位。方法: 以成人肝cDNA文库为模板， PCR扩增ALDH8A1目的片段， 并构建重组表达载体pGEX4T1ALDH8A1和pET32aALDH8A1， 经测序鉴定插入载体的DNA片段序列正确后， 转化大肠杆菌BL21， 诱导表达GSTALDH8A1和 HisALDH8A1融合蛋白。经Western blot确定其为目的蛋白后， 纯化重组融合蛋白， 并以GSTALDH8A1免疫家兔制备抗人ALDH8A1多克隆抗体。用HisALDH8A1包板， ELISA法测定兔抗人ALDH8A1血清效价; Western blot鉴定兔抗人ALDH8A1血清在重组蛋白和天然蛋白中的反应特异性; 免疫组化法确定ALDH8A1蛋白在组织和细胞中的定位。结果: 成功构建重组表达载体pGEX4T1ALDH8A1和pET32aALDH8A1; 获得包涵体形式表达的GSTALDH8A1和可溶性形式表达的 HisALDH8A1融合蛋白; 应用纯化的重组蛋白GSTALDH8A1免疫家兔， 获得兔抗人ALDH8A1血清， ELISA测定抗血清的效价为1∶256 000。Western blot结果显示， 制备的ALDH8A1兔多抗可特异地识别成人肝总蛋白以及293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞总蛋白中一个相对分子质量（Mr）约53 000的ALDH8A1天然蛋白， 与文献报道的ALDH8A1的Mr一致， 表明ALDH8A1在正常肝组织与癌细胞中都有表达。免疫组化结果表明ALDH8A1蛋白定位于人肝癌细胞胞质中。结论: 成功制备出兔抗人ALDH8A1多克隆抗体， 此抗体可应用于ELISA， Western blot和免疫组化检测， 为进一步研究ALDH8A1的功能奠定了基础。

【关键词】 ALDH8A1; 重组蛋白; 多克隆抗体

　　ALDH8A1（aldehyde dehydrogenase 8 family member A1）的基因定位于人类染色体6q23.2， 编码487个氨基酸， 又名ALDH12。ALDH8A1是一个细胞溶质酶， 在体内9顺式视黄酸的生物合成途径中具有重要作用。与全反式视黄醛相比， ALDH8A1是第一个已知的更偏向于9顺式视黄醛结合的醛脱氢酶［1， 2］， 它能够将9顺式视黄醛氧化为9顺式视黄酸。9顺式视黄酸生物学活性较强， 可通过核维甲酸受体（RAR）结合于DNA应答元件调节靶基因的转录; 尚能与维甲酸X受体（RXR）结合， 在调控细胞生长、 分化、 凋亡等生命活动中起重要作用。ALDH8A1在非酒精性脂肪肝（NASH）患者中呈上调表达， 这可能与其在能量和代谢途径中的氧化作用相关［3， 4］。我们通过原核表达系统重组表达ALDH8A1蛋白， 免疫家兔， 获得了抗ALDH8A1的多克隆抗体（pAb）， 并进行抗体特异性鉴定， 及ALDH8A1在组织和细胞内的定位。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 成人肝cDNA文库购自Clonetech公司。大肠杆菌DH5α和BL21菌株为本实验室保存。pGEX4T1和pET32a载体购自Novagen公司。DNA聚合酶Ex Taq， 限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ， T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司。DNA回收试剂盒， 质粒提取试剂盒购自Omega公司。IPTG诱导剂购自Merck公司。雄性大耳白兔购自军事医学科学院动物中心。弗式佐剂购自Sigma公司。PVDF膜购自Amersham公司。HRP羊抗兔IgG、 poly Helper购自北京中杉金桥公司。ECL反应试剂盒购自Amersham公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ALDH8A1重组蛋白的表达、 纯化及鉴定 根据Human Protein Reference Database提供的ALDH8A1的氨基酸序列， 应用生物信息学软件DNAstar进行抗原表位分析后， 选取27119 aa片段进行引物设计并重组表达。片段全长279个核苷酸， 在其上游引物设计EcoRⅠ酶切位点， 下游引物设计XhoⅠ酶切位点， 用成人肝cDNA文库为模板进行PCR扩增， 琼脂糖凝胶电泳并回收扩增的目的片段。回收片段及pGEX4T1和pET32a载体经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后， 以适当比例将目的片段分别与两个载体连接并转化大肠杆菌DH5α， 阳性克隆经测序证明插入片段序列正确后抽提质粒， 转化大肠杆菌BL21， 诱导表达GSTALDH8A1和HisALDH8A1蛋白并纯化。将纯化的蛋白经SDSPAGE后， 电转移至PVDF膜上。封闭过夜， 加入兔抗GST标签多抗室温孵育1 h， 加入HRP羊抗兔IgG， 室温孵育45 min， ECL显色， 于暗室曝光显影， 用以检测目的蛋白。

　　1.2.2 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的制备 将重组GSTALDH8A1蛋白以生理盐水稀释， 与等体积弗氏完全佐剂充分混匀并乳化后， 每只家兔皮下多点注射800 μg; 4周后第2次免疫400 μg（后不完全佐剂）; 4周后加强免疫800 μg; 1周后颈动脉放血， 于37℃放置2 h， 4℃沉淀过夜后， 离心分离血清， 分装后置-20℃保存。

　　1.2.3 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的鉴定 （1）ELISA检测ALDH8A1抗血清效价: 检测板用HisALDH8A1融合蛋白（1 mg/L）包被， 每孔100 μL， 4℃过夜。每孔加入200 μL封闭液， 37℃封闭2 h。每孔加入100 μL以1∶4梯度稀释的抗血清（阴性对照为正常兔血清， 空白对照为封闭液）， 37℃孵育30 min。加入HRP羊抗兔IgG， 37℃孵育30 min。TMB显色后， 酶标仪450 nm处读值。（2）Western blot检测兔抗人ALDH8A1 pAb与重组蛋白和天然蛋白的反应特异性: 将重组HisALDH8A1蛋白、 成人肝匀浆总蛋白及多种肿瘤细胞总蛋白经SDSPAGE后， 电转移至PVDF膜上。封闭过夜后， 加入兔抗人ALDH8A1 pAb， 以正常兔血清作为阴性对照， 室温孵育1 h， 加入HRP羊抗兔IgG， 室温孵育45 min后， ECL显色， 于暗室曝光显影。（3）免疫组化鉴定: 将人肝癌组织石蜡切片脱蜡后， 滴加30 mL/L h3O2处理10 min。在抗原修复盒内以0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液保持92℃～98℃， 持续15 min。滴加正常羊血清37℃封闭30 min， 加入ALDH8A1兔多抗， 4℃孵育过夜。滴加poly Helper， 37℃孵育30 min， 增加组织通透性。加入HRP羊抗兔IgG， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 封片。

　　2 结果

　　2.1 ALDH8A1重组融合蛋白的表达、 纯化及鉴定 经PCR扩增得到了ALDH8A1目的片段， 分别构建GSTALDH8A1和HisALDH8A1质粒， 并转化大肠杆菌BL21。经 IPTG诱导后， 分别表达出包涵体形式的重组GSTALDH8A1和可溶性形式的重组HisALDH8A1蛋白， 其Mr分别为36 000和29 000， 与预测的ALDH8A1融合蛋白Mr相一致， 经纯化后蛋白纯度均高于80%。通过Western blot鉴定， 重组GSTALDH8A1蛋白可被抗GST标签的抗体识别， 重组HisALDH8A1蛋白可被抗His标签的抗体识别（图1）。

　　图1 ALDH8A1融合蛋白的Western blot分析（略）

　　1: GSTALDH8A1融合蛋白; 2: HisALDH8A1融合蛋白.

　　2.2 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体的鉴定 （1）用重组HisALDH8A1蛋白包被检测板， ELISA检测兔抗人ALDH8A1血清的效价为1: 256 000。（2）Western blot结果表明， 兔抗ALDH8A1血清与BL21空菌对照（图2， 泳道1）无反应; 与重组HisALDH8A1蛋白（图2， 泳道2）及GST标签蛋白（图2， 泳道3）有反应， 所识别条带的Mr分别为29 000与26 000， 证明兔抗血清中包含了抗目的蛋白ALDH8A1及标签蛋白GST的抗体。另外， 兔抗血清可以识别正常成人肝总蛋白中Mr为53 000的蛋白（图2， 泳道5）， 这与文献报道的ALDH8A1天然蛋白Mr一致。以293T、 A549、 HeLa、 U937、 HepG2细胞系总蛋白作为抗原， ALDH8A1抗血清作为一抗进行Western blot检测， 结果显示， 在53 000处均有明显条带， 证明ALDH8A1兔多抗能够识别多种肿瘤细胞系中的ALDH8A1天然蛋白（图3）。（3）免疫组化结果表明， 以人肝癌组织切片进行检测， 兔抗人ALDH8A1多克隆抗体识别的抗原定位于肝癌细胞胞质内（图4）。

　　图2 兔抗人ALDH8A1抗血清的Western blot分析（略）

　　1: E.coli BL21对照; 2: HisALDH8A1融合蛋白; 3: GST蛋白; 4: 成人肝脏总蛋白; 5: 成人肝脏总蛋白．

　　图3 用Western blot分析兔抗人ALDH8A1血清对不同肿瘤细胞蛋白的识别（略）

　　1: 293T细胞裂解蛋白; 2: A549细胞裂解蛋白; 3: HeLa细胞裂解蛋白; 4: U937细胞裂解蛋白; 5: HepG2细胞裂解蛋白．

　　图4 免疫组化检测ALDH8A1在肝癌组织中的表达（略）

　　A: 人肝脏正常组织; B: 人肝脏癌变组织．

　　3 讨论
　　
　　ALDH8A1蛋白的Mr约为53 000， 含有487个氨基酸， 含有23个不变氨基酸和4个保守区域， 以及ALDH家族具有代表性的半胱氨酸残基。该蛋白在成人肝及胎肝、 肾脏中表达量较高， 这可能与9顺视黄醇高度集中在这两个器官有关［5］。近年来， 有报道指出， 9顺视黄酸能够诱导肿瘤细胞凋亡， 而ALDH8A1则是9顺视黄醇转化为9顺视黄酸最为关键的酶， 调节了视黄醇的分配， 并维持着机体视黄醇的平衡。在已知的维甲酸类化合物中， 只有9顺视黄酸既能与核维甲酸受体又能与核维甲酸X受体结合发挥其生物学效应， 从而影响细胞DNA的合成， 改变细胞周期和信号传导途径， 还可以影响某些癌基因及细胞因子基因的表达。
　　
　　本研究中， 我们通过抗原表位分析， 选取了ALDH8A1的27119aa， 以原核表达系统重组表达了GSTALDH8A1和HisALDH8A1融合蛋白， 并以GSTALDH8A1为免疫原， 以HisALDH8A1为检测原， 成功制备了兔抗人ALDH8A1多克隆抗体。对其进行特异性鉴定， 结果表明兔抗人ALDH8A1多克隆抗体能够特异地识别重组表达的ALDH8A1蛋白， 并能够特异地识别成人肝总蛋白中以及多种肿瘤细胞蛋白中的ALDH8A1天然蛋白。免疫组化结果显示兔抗人ALDH8A1多克隆抗体能够与人肝癌组织呈阳性反应。所制备的兔抗人ALDH8A1多克隆抗体对ALDH8A1具有很好的特异性识别， 可应用于ELISA、 Western blot及免疫组化的检测。该抗体的获得可为进一步研究 ALDH8A1在NASH等多种代谢疾病的发生、 发展过程中确切的分子机制提供必要的工具。

参考文献

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　　［5］ Lin M， Zhang M， Abraham M. Mouse Retinal dehydrogenase 4 (RALDH4)， molecular cloning， cellular expression， and activity in 9cisretinoic acid biosynthesis in intact cells［J］. J Biol Chem， 2003， 278(11): 9856-9861.