原发性乳腺癌组织中KLK6蛋白和mRNA的表达及其临床病理学意义

　　　　 作者：王守满， 毛杰， 李波， 吴畏， 唐利立

【摘要】 目的: 探讨KLK6蛋白及其mRNA在原发性乳腺癌组织中的表达和临床意义。方法: 随机选取原发性乳腺癌患者88例并收集其术后标本， 采用SABC免疫组化方法和RTPCR技术， 检测乳腺癌组织和正常乳腺组织中KLK6蛋白及其mRNA的表达。并分析其与原发性乳腺癌组织临床病理学特征之间的关系。结果: KLK6蛋白在原发性乳腺癌组织中的阳性表达率为78.40% (69/88)， 并与癌组织的临床病理学特征有关; 发生淋巴结转移及ER(+)的癌组织中KLK6蛋白的阳性表达率明显低于未转移组(P&<0.05)及ER(-)组(P&<0.05)。KLK6 mRNA在原发性乳腺癌组织中的表达水平显著高于正常乳腺组织(P&<0.01); 但发生淋巴结转移的癌组织中， KLK6 mRNA的表达水平明显低于未转移组(P&<0.05); ER+组亦低于ER(-)组(P&<0.05)。KLK6蛋白及其mRNA的表达与乳腺癌相关基因CerbB2 的表达无相关性(P&>0.05) 。结论: KLK6蛋白及其mRNA的异常表达可能与原发性乳腺癌的发生、 浸润、 转移有关， 可以作为一个肿瘤标志物在临床中应用。

【关键词】 原发性乳腺癌; 临床病理学; KLK6; mRNA

　　Kallikreins (KLKs)是一类新发现的、 与性激素相关的肿瘤基因家族［1］。KLK6是KLK基因家族的成员之一， 其编码的蛋白人组织型激肽释放酶6 (human kallikrein 6， hK6) 是由223个氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶， 具有胰蛋白酶样活性。研究表明重组的hK6在体外能降解胞外基质蛋白， 推测其可能在肿瘤的浸润中起作用， 目前KLK6参与肿瘤发生发展的确切机制尚不清楚［2］。原发性乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤， 其浸润和转移过程较为复杂， 发病机制尚未明确， 目前患者的治疗效果不佳［3］。因此， 寻找原发性乳腺癌侵袭转移的相关因子， 对于指导治疗、 提高术后生存率均有十分重要的意义。我们应用免疫组织化学染色技术（SABC法）和逆转录聚合酶联反应（RTPCR）技术， 检测KLK6蛋白及其mRNA在正常乳腺组织和原发性乳腺癌组织中的表达， 探讨其与原发性乳腺癌临床病理学特征的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 2000-07/2002-07经病理确诊为原发性乳腺癌患者88例， 年龄48.9±2.6 (26～69)岁， 排除原位癌。患者术前均未行化放疗。其中TNMⅠ～Ⅱ期58例， TNM Ⅲ～Ⅳ期30例。病理类型: 浸润性导管癌33例， 单纯癌35例， 导管内癌11例， 黏液腺癌9例。对照组标本20例， 为非肿瘤组织中的正常乳腺组织。鼠源性抗人KLK6 mAb（工作浓度1∶500， # ABIN188148）和免疫组织化学染色采用SABC法试剂盒均购自上海生工生物技术有限公司。生物素化二抗、 辣根酶标记链酶卵白素复合物均购自福州迈新生物技术开发公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组化SABC检测 采用免疫组织化学染色SABC法。标本依次进行以下处理: 多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 4 μm连续切片， 于70℃烤片15 min后， 依次进行脱蜡、 水化、 梯度乙醇脱水， 30 mL/L h3O2灭活内源酶， PBS漂洗5 min×3次。正常山羊血清室温孵育15 min。滴加20～30 μL PBS 稀释的一抗4℃过夜。PBS 漂洗5 min×3次。生物素化二抗、 辣根酶标记链酶卵白素复合物依次在37℃下， 孵育45 min， PBS漂洗5 min×3次。DAB显色5～10 min， 自来水充分洗涤， 苏木素复染5 min， 稀盐酸淡化30 s， 冲洗5 min。脱水、 透明、 封片， 镜检。设KLK6蛋白表达阳性的结肠癌组织为阳性对照， 用PBS替代第一抗体作阴性对照。KLK6蛋白表达阳性为癌细胞的细胞质出现棕黄色颗粒， 不出现者为阴性。在400×光镜下观察10个视野， 每个视野计数100个细胞， 阳性细胞率小于20%为阴性， 阳性细胞率大于等于20%为阳性［4， 5］（此处的标准设定依据: 参照

参考文献

中的KLK6蛋白在其他种类肿瘤中阳性表达判定的标准; 经预实验结果进行进一步确定）。

　　1.2.2 RTPCR 技术检测 TRIzol为Invitrogen公司产品， 按操作说明书步骤提取每例标本的总RNA后， 在扩增仪上进行RTPCR。根据紫外分光光度计测得各管总RNA质量浓度。当质量浓度在800～1 400 mg/L时， 各取4 μL总体积的RNA 逆转录成cDNA。逆转录条件: 加水至反应体系20 μL， 42℃ 1 h， 70℃变性10 min， 反应完毕后取出， 冰上放置5 min， 将生成的cDNA置于-20℃保存。分别取一定量的cDNA进行PCR扩增， 加引物1 μL， 模板1.2 μL， 其余按说明操作。参考cDNA文库， 利用PRIMER 5.0设计引物序列， 所有引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。KLK6: 上游引物5′TTC CTG CCA GGG TGA TTC T3′， 下游引物5′CAC TTG GCC TGA ATG GTT TT3′， 片段长度162 bp。GAPDH（内参）: 上游5′ACA GTC CAT GCC ATC ACT GCC3′， 下游5′GCC TGC TTC ACC ACC TTC TTG3′， 片段长度为269 bp。PCR 条件: 94℃ 3 min， 94℃ 45 s， 61℃退火45 s， 72℃延伸45 s; 扩增32个循环。

　　1.2.3 统计学分析 所有数据用SPSS13.0处理， 计数资料用x±s表示， 采用χ2检验。P&<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 KLK6蛋白的表达及其与原发性乳腺癌临床病理学参数的关系 免疫组织化学染色结果显示， 原发性乳腺癌组织中， KLK6蛋白的阳性表达主要定位于癌细胞的细胞质， 呈弥漫分布的棕黄色颗粒， 强弱不等。KLK6蛋白的阳性表达率为78.40% (69/88)， 而在正常乳腺组织中的阳性表达率为3% (6/20)。KLK6蛋白在原发性乳腺癌组织中的表达情况与患者临床病理参数之间的关系见表1。经统计学分析可知， KLK6蛋白的表达与患者性别、 年龄、 肿瘤发生部位及大小均无相关性(P&>0.05); 有淋巴结转移及雌激素受体阳性的癌组织中KLK6蛋白的阳性表达率明显低于未转移及雌激素受体阴性的组织(P&<0.01， 0.05); 孕激素受体阳性组与孕激素受体阴性组差异不显著(P&>0.05); 与乳腺癌相关基因CerbB2 的表达亦无关联(P&>0.05) 。表1 KLK6蛋白表达与原发性乳腺癌临床病理参数的关系

　　2.2 KLK6 mRNA的表达及其与原发性乳腺癌临床病理学参数的关系 原发性乳腺癌组织中KLK6 mRNA的表达水平明显高于正常乳腺组织（P&>0.05）。有淋巴结转移及雌激素受体阳性的癌组织中KLK6 mRNA的表达水平显著低于未转移及雌激素受体阴性的组织(P&<0.05或0.01， 表2); 孕激素受体阳性组与孕激素受体阴性组差异不显著(P&>0.05); 与乳腺癌相关基因CerbB2 的表达亦无关联(P&>0.05) 。表2 KLK6mRNA表达水平与原发性乳腺癌临床病理参数的关系

　　3 讨论

　　研究表明原发性乳腺癌的侵袭、 转移是多基因变化、 相互作用， 尤其是叠加作用的结果［6， 7］， 但是目前仍然不清楚乳腺癌发生发展和浸润转移的具体分子机制。因而， 研究乳腺癌的相关基因不仅有利于理解其发病机制， 还可能发现在诊断和评价预后中具有重要临床意义的分子标记物。

　　人组织型激肽释放酶基因家族(kallikrein， KLK) 位于人染色体19q13.3～13.4 区域之间， 共包括15个成员， 编码一组具有丝氨酸蛋白酶活性的人组织型激肽释放酶(human kallikrein， hK)［8， 9］。大多数KLK基因在甾体激素依赖性器官中表达， 与类固醇激素调节密切相关。还有研究表明， KLK基因及其编码的系列蛋白参与肿瘤细胞生长的调控、 肿瘤血管的形成和胞外基质的重建， 可促进或抑制肿瘤的浸润转移， 是一类新型的肿瘤标志家族［10］。KLK6作为KLK基因家族的成员之一， 长约162 bp。该基因在卵巢、 子宫、 睾丸等激素依赖性器官的肿瘤中异常表达， 与预后相关; 且联合检测患者血清hK6和CA125 的水平将明显提高卵巢癌诊断的特异性和敏感性［11， 12］。目前KLK6 参与肿瘤发生发展的确切机理尚不清楚。为揭示KLK6 基因表达与原发性乳腺癌临床病理特征的关系， 我们应用免疫组织化学染色方法和RTPCR方法检测KLK6蛋白和mRNA在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达， 证实KLK6基因在乳腺癌细胞中的表达显著高于正常乳腺组织。在有淋巴结转移的乳腺癌组织中， KLK6的表达水平比为发生转移的明显下降。可见， KLK6基因在肿瘤早期高表达， 随着肿瘤的发展， 表达逐渐减弱， 但表达水平仍高于正常乳腺组织。此外， 本实验结果还发现， KLK6的表达与乳腺癌组织的雌激素受体有关， 但与孕激素受体和原癌基因CerbB2无关。

　　综上所述， KLK6蛋白和mRNA高表达于原发性乳腺癌组织， 转移后期表达水平下降， 与肿瘤的转移有关， 同时， 其表达受雌激素调控。这些提示KLK6基因是一种由雌激素调控且参与原发性乳腺癌发生、 发展的相关基因， 可用于临床诊断， 具有重要的参考价值。

参考文献

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［10］ Darling MR， JacksonBoeters L， Daley TD， et al. Human kallikrein 6 expression in salivary gland tumors［J］. J Histochem Cytochem， 2006， 54(3): 337-342.

［11］ Qu S， Long J， Cai Q， et al. Genetic polymorphisms of metastasis suppressor gene NME1 and breast cancer survival［J］. Clin Cancer Res， 2008， 14(15): 4787-4793.

［12］ Crabb SJ， Cheang MC， Leung S， et al. Basal breast cancer molecular subtype predicts for lower incidence of axillary lymph node metastases in primary breast cancer［J］. Clin Breast Cancer， 2008， 8(3): 249-256.