Smad7而非Smad6基因可抑制TGFβ诱导肾小管上皮间充质转分化

　　　　 作者：黄云剑， 王梓华， 张静波， 梁莉， 陈枫， 赵景宏

【摘要】 目的: 观察Smad6和Smad7基因能否抑制TGFβ诱导肾小管上皮间充质转分化。方法: 构建产生表达Smad6和Smad7基因的无辅毒腺相关病毒载体， 再将病毒颗粒分别转染入人肾小管上皮细胞（HKC）， 细胞随机分为正常对照、 TGFβ1组、 Smad7 组、 LacZ组、 TGFβ1+Smad7或Smad6组、 TGFβ1＋LacZ组。10 μg/L TGFβ1添加入培养液孵育15、 30、 60、 120 min和3 d。Western blot测定TGFβ1和Smad6或Smad7基因转染对细胞pSmad2、 Ecadherin、 αsmooth muscle actin（αSMA）表达的影响， ELISA法测定培养上清羟脯氨酸的含量的变化， 倒置显微镜观察细胞形态变化。结果: 与未加TGFβ1细胞相比， 添加TGFβ1后15、 30、 60、 120 min胞内Smad2磷酸化水平明显增加， 30 min时表现最大。10 μg/L TGFβ1与HKC孵育72 h后， 细胞αSMA和羟脯氨酸量合成增加， Ecadherin表达减少; 细胞形态变长， 呈纺锤状细胞， 失去鹅卵石样的形状。Smad7基因转染可抑制TGFβ1诱导Smad2磷酸化， 抑制细胞αSMA和羟脯氨酸合成， 增加Ecadherin表达， 维持培养细胞的上皮样形态， 相反， Smad6没有这样的作用。结论: Smad7而不是Smad6基因转染能抑制TGFβ1诱导肾小管上皮间充质转分化， 这些作用可能与Smad7阻断Smad2磷酸化有关。

【关键词】 Smad7; Smad6; 上皮间充质转分化; TGFβ; 基因治疗

　　肾小管上皮间充质转分化（epithelial mesenchymal transition， EMT）是肾小管间质纤维化(Tubulointerstitial fibrosis， TIF)发生的重要原因之一， 超过1/3的间质成纤维细胞来源于EMT， 因此， 寻找减缓EMT的方法是TIF研究的重点［1， 2］。TGFβ是EMT的重要诱导剂之一， 减少其对小管上皮的影响可能对TIF治疗有帮助。Smad6和Smad7蛋白是TGFβ家族细胞内信号转导的负调控蛋白（InhibitorySmads， ISmad）［3］。ISmads能与活化的TGFβⅠ型受体牢固结合， 阻止Smad2和Smad3磷酸化， 未磷酸化的Smad2和Smad3不能形成转录复合物进入核内， 从而阻断了TGFβ对靶基因的转录。我们以往的研究发现Smad6和Smad7表达下调可能是TGFβ 高表达致TIF的主要原因， 但提高它们的表达能否抑制TGFβ诱导的EMT尚不清楚［4］。为此， 我们采用腺相关病毒将Smad6和Smad7基因分别转染入人肾小管细胞中， 观察其能否抑制TGFβ诱导的EMT， 并分析其细胞内信号转导机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 限制性核酸内切酶BamH I、 Xho I及T4连接酶， 均购自TaKaRa公司。Wizard PlusSV Minipreps DNA Purification System和Wizard PureFectionPlasmid DNA Purification System质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒， 均购自Promega公司。TGFβ1和兔抗Flag M2抗体购自Sigma公司， 兔抗phosphoSmad2抗体购自upstate biotechnology公司， 兔抗αSMA抗体购自Dako公司， 兔抗Ecadherin抗体购自B＆D公司。AAV HelperFree System（pAAVMCS vector、 pAAVLacZ vector、 pAAVRC plasmid、 pHelper plasmid）和XL10Gold感受态细菌， 购自Stratagene公司。E.coli DH5α由本校分子遗传教研室馈赠。含全长Smad6/Flag和Smad7/Flag融合基因表达质粒， 由瑞典Serhiy Souchelnytskyi博士惠赠。HEK 293和HKC细胞购自美国ATCC。

　　1.2 方法

　　1.2.1 Smad6和Smad7 AAV的产生及鉴定 首先将Smad6/Flag和Smad7/Flag片段从质粒pcDNA3中用EcoR I/BamH I双酶切出， 再克隆到pAAVMCS vector质粒的多克隆位点， 正式命名为pAAVSmad6/Flag和pAAVSmad7/Flag质粒。按Stratagene公司AAV HelperFree System转染试剂盒以磷酸钙沉淀的方法产生Smad6和Smad7 AAV。以1 mL病毒储存液感染HKC细胞48 h后表达转移基因阳性细胞数（SABC组化）来计算。

　　1.2.2 HKC细胞的培养及实验分组 HKC细胞用含100 mL/L的胎牛血清， 100 U/mL青霉素、 100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液传代培养， 培养条件为37℃、 50 mL/L CO2。细胞随机分为正常对照、 TGFβ1组、 Smad7 组、 LacZ组、 TGFβ1+Smad7或Smad6组、 TGFβ1＋LacZ组。实验分三步骤进行， 第一步观察10 μg/L TGFβ1对HKC细胞磷酸化Smad2水平的影响， 时相点设为0、 15、 30、 60、 120 min; 第二步观察不同AAV滴度ISmad转染HKC对TGFβ1诱导上皮间充质转分化的影响， 时相点为72 h。

　　1.2.3 Western bot 分析 细胞经PBS冲洗后， 加入RIPA裂解液（10 g/L Nonidet P40， 50 mmol/L TrisHCl， 150 mmol/L NaCl， 2 mmol/L EDTA， 1 mL/L SDS， 10 mL/L TritonX100， PMSF 50 mg/L， Leuptin 5 mg/L）30 min匀浆提取蛋白， 4℃ 12 000 g离心20 min， 取上清以Micro BCA protein Kit 测定蛋白质含量。取等量蛋白质经煮沸5 min后行SDSPAGE垂直凝胶电泳， 电转移蛋白质到PVDF膜上， 膜在50 mL/L牛血清白蛋白TBST液（10 mmol/L Tris·HCl， 150 mmol/L NaCI， 0.5 mL/L Tween20， pH8.0）封闭， 37℃室温1 h， TBST洗膜后分别与不同一抗AntiphosphoSmad2（1∶1 000）、 Ecadherin（1∶1 000）， αsmooth muscle actin（1∶1 000）、 β actin（1∶1 000）抗体孵育37℃， 2 h， 依次再用生物素标记的二抗杂交和辣根酶标记链酶卵白素液孵育， 37℃， 1 h， TBST洗膜后在暗室中加ECL发光试剂， X光胶片下曝光， 常规方法显影、 定影， 直至显影出电泳带。使用Bio Rad 5000图像系统采集电泳图像， Verso Doc软件检测蛋白质条带的吸光度（A）值， 以β actin为内参照进行半定量分析。

　　1.2.4 培养上清中羟脯氨酸的含量 严格按试剂盒说明书方法操作， 用M550型酶标仪在550 nm处检测A值， 通过下列公式计算样品中羟脯氨酸含量。样品中羟脯氨酸浓度(mg/L)=(测定管A值-空白管A值)/(标准管A值-空白管A值)。

　　1.2.5 培养细胞形态的变化 观察正常对照组， TGFβ1组， TGFβ1+Smad7组， TGFβ1+Smad7组细胞的形态变化。

　　1.2.6 统计学分析 实验数据以x±s表示， 用SPSS13.0统计软件进行组间方差分析， P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 重组AAV的产生及病毒滴度 分别取10 μg的质粒pAAVLacZ或pAAVSmad6/Flag或pAAVSmad7/Flag和各10 μg的 pAAVRC和pHelper质粒经磷酸钙沉淀法共转染HEK293细胞后2～3 d。pAAVLacZ转染组经原位βGalactosidase 染色细胞后可见细胞呈蓝色。转染Smad6和Smad7 AAV的细胞， 约90％以上的肾小管上皮细胞可有效表达Smad6和Smad7蛋白， 染色后可见阳性细胞呈棕色。平均病毒病毒滴度分别为rAAVlacZ 2×1010 IU/mL， pAAVSmad6/Flag 3×1010 IU/mL， pAAV Smad7/Flag 3×1010IU/mL（图1）。

　　2.2 TGFβ1和ISmad基因转染对pSmad2的表达的影响 Western blot结果显示， HKC细胞和TGFβ1孵育0、 15、 30、 60、 120 min后， 细胞pSmad2水平增加， 其作用在30～60 min时表现最大， 表明TGFβ1可诱导细胞内Smad2磷酸化（图2）。

　　1×1010滴度Smad7基因转染HKC后30 min， Western blot结果显示Smad7基因转染可抑制TGFβ1诱导的Smad2磷酸化水平， 而Smad6基因转染不能抑制TGFβ1诱导的Smad2磷酸化（图3、 4）。

　　2.3 ISmad基因转染对TGFβ诱导肾小管上皮间充质转分化的影响 Western结果显示， 10 μg/L TGFβ1处理HKC细胞后72 h， 与正常对照组相比， 细胞αSMA表达增加， 而Ecadherin表达减少。与TGFβ1组相比， TGFβ1＋Smad7组细胞αSMA减少， Ecadherin表达明显增加。TGFβ1＋Smad6组αSMA、 Ecadherin表达均无明显变化， 表明Smad7基因转染可拮抗TGFβ1诱导肾小管上皮间充质转分化， 而Smad6没有这样的作用(图5～8)。

　　2.4 ISmad基因转染对培养上清中羟脯氨酸的含量的影响 ELISA结果显示， 10 μg/L TGFβ1处理HKC细胞后72 h， 与正常对照组（3.37±0.41)mg/L相比， 细胞培养上清中羟脯氨酸的含量（6.12±0.55) mg/L明显增加。与TGFβ1组相比， TGFβ1＋Smad7组细胞上清羟脯氨酸的含量（4.15±0.46)mg/L明显降低， 而Smad6组（6.15±0.56)mg/L无明显变化， 表明Smad7基因转染可拮抗TGFβ1诱导肾小管羟脯氨酸的合成， 而Smad6没有这样的作用。

　　2.5 培养细胞形态的变化 10 μg/L TGFβ1作用72 h后细胞形态变长， 呈纺锤状细胞， 失去鹅卵石样的形状， 表明肾小管细胞向肌纤维细胞形状转变。与TGFβ1组相比， TGFβ1＋Smad7组细胞能维持上皮样形态， 而TGFβ1＋Smad6组细胞不能维持上皮样形态， 呈纺锤状细胞(图9)。

　　3 讨论

　　TIF是各种肾脏疾病进展至肾衰竭的共同通路， 减缓TIF的进展一直是慢性肾病治疗的重点之一［5］。TIF主要表现为小管细胞消失和间质细胞外基质（ECM）的堆积。ECM主要由纤维连接蛋白和胶原蛋白组成。尽管肾小管细胞能合成部分ECM， 但肌成纤维细胞是ECM的主要来源。研究表明， 肌成纤维细胞的来源可能有: ①肾间质固有成纤维细胞; ②肾髓源性干细胞; ③EMＴ， 其中EMT是肾脏纤维化中肌成纤维细胞的主要来源， Iwano等［2］报道大约36％的肌成纤维细胞来源于肾脏局部EMT。因此， 探讨EMT成因和阻断措施对减缓TIF的进展具有重要意义。本研究结果显示， HKC细胞和TGFβ1孵育0、 15、 30、 60、 120 min后， 细胞pSmad2水平增加， 说明TGFβ通过Smad2的磷酸化实现其胞内信号转导。Smads蛋白是TGFβ细胞内的主要信号转导蛋白， TGFβ首先与其II型受体结合， 活化的II型受体蛋白激酶使I型受体磷酸化， 活化的I型受体蛋白激酶作用于Rsmads(Smad2， 3)， 使其磷酸化， 随后Smad2， 3与4形成异源寡聚体复合物， 移入核内， 在核内其与目的基因启动子区的Smads反应元件结合， 启动基因转录， 包括胶原基因、 ISmad基因等。Ellis等［6］发现I， III 和V胶原基因均含有Smad2， 3， 4的结合位点。PAI1基因启动子740和647位点存在有TGFβ反应元件， 活化的Smad形成的转录复合物与此元件结合后， 可增强PAI1基因的转录［7］， 由此影响纤溶酶原/纤溶酶的活性。Hu等［8］还证实alphaSMA基因的启动子中含有二个Smad3反应区， Smad3可促进αSMA的表达， 因此阻抑受体活化的Smad(Smad2， 3)磷酸化， 是减弱TGFβ信号， 控制EMT的关键。Smad6和Smad7蛋白是TGFβ家族细胞内信号转导的负调控蛋白。TGFβ活化I型受体同时也激活ISmad， Smad7通过与Smad2和Smad3竞争性结合I型受体， 抑制其磷酸化并干预核内功能性SmadDNA的形成［9］; 另一方面Smad7还可与smurfl/2结合， 通过泛素化途径降解I型受体， 对TGFβ细胞内信号转导进行负反馈调节［10］。Smad6主要负调控蛋白骨形态发生蛋白（BMP）和部分TGFβ的细胞内信号转导［11］。既往我们建立单侧输尿管梗阻性肾病肾小管间质纤维化模型， 发现Smad6和Smad7表达下调可能是TGFβ 高表达致TIF的主要原因， 但提高它们的表达能否抑制TGFβ诱导的EMT尚不清楚。本研究结果显示， Smad7基因转染可抑制TGFβ1诱导Smad2磷酸化， 而Smad6基因转染不能抑制TGFβ1诱导的Smad2磷酸化， 说明Smad2磷酸化只受Smad7调控。Smad6不具有这样的作用， 我们分析这可能与Smad6主要影响Smad1和Smad5的磷酸化［12］， 参与调控BMP信号通路作用有关。Zhao等［13］发现Smad7而不是Smad6可抑制TGFβ诱导的胚胎肺的形态发生; HillKapturczak等［14］还证实Smad7而不是Smad6可抑制TGFβ对肾小管细胞血红素加氧酶的抑制．因此， 控制Smad2的活化可能是Smad7减弱TGFβ信号的分子机制基础。

　　从ECM产生这个角度来看， 激活产生ECM的效应细胞被认为是肾脏纤维化的核心。研究已经揭示肌成纤维细胞是ECM的主要来源， 肾脏纤维化中肌成纤维细胞的主要来源于EMT［2， 5］。肾小管发生EMT时主要表现以下特点: ①细胞极性消失; ②细胞Ecadherin表达受抑制和紧密连接消失; ③表达波形纤维蛋白; ④表达αSMA。其中Ecadherin是上皮细胞的标记分子， 对维持上皮细胞间紧密连接， 稳定上皮细胞表型具有重要的作用， αSMA是MFB的标记分子［15］。倒置显微镜观察10 μg/L TGFβ1作用72 h后细胞形态变长， 呈纺锤状细胞， 失去鹅卵石样的形状， 表明肾小管细胞向纤维细胞形状转变。Smad7基因转染可抑制TGFβ1诱导的Ecadherin表达下降和αSMA表达增加， 降低培养上清中羟脯氨酸的含量， HKC能维持上皮样形态， 向纤维细胞形状转变不明显， 而Smad6转染组不具有这样的作用， 说明Smad7基因转染可抑制TGFβ诱导的肾小管上皮细胞转分化， 从而减少肌成纤维细胞的数目， 最终减轻肾小管间质纤维化。

　　总之， Smad7基因转染可抑制TGFβ诱导的肾小管细胞上皮－间充质的转分化， 其作用途径可能是通过抑制Smad2磷酸化， 干预下游Smad介导的细胞内信号转导， 维持Ecadherin表达， 减少αSMA表达， 降低细胞合成ECM蛋白有关， 而Smad6基因转染不具有这样的作用。

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