BMP2和FGF2对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

　　 作者：张为西， 陈松林， 姚晓黎， 卢锡林， 周琛， 冷雁， Xingming Shi

【摘要】 目的: 观察骨形成蛋白（BMP2）和成纤维细胞生长因子2（FGF2）对小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的影响。方法: 取3~18月雄性C57BL/6J小鼠（共50只）的骨髓细胞， 分离贴壁培养后， 用免疫磁珠法纯化， 并鉴定为MSCs后， 再进行贴壁培养24 h后， 分别在成骨细胞诱导培养液中加入100 μg/L BMP2和0.5 nmol/L FGF2持续诱导7、 14、 21 d后， 进行碱性磷酸酶染色、 碱性磷酸酶活性检测， Vonkossa染色以及茜素红染色， 并用递转录荧光定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因(Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen1、 osteocalcin)的表达情况。结果: BMP2刺激组的ALP活性以及钙化结节明显高于对照组， Runx2/cbfa1， ALP， collage1， osteocalcin的mRNA呈高表达; FGF2刺激组的ALP活性以及钙化结节也高于对照组， Runx2/cbfa1、 Alp、 collagen1、 osteocalcin的mRNA表达量也高于对照组， 但不如BMP2明显。 结论: BMP2和 FGF2在不同程度上促进体外培养的小鼠MSCs向成骨细胞方向分化。

【关键词】 小鼠; 骨髓间质干细胞; BMP2; FGF2

　　骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， MSCs）具有自我更新和多向分化的潜能， 可向成骨细胞、 脂肪细胞、 软骨细胞、 肌肉细胞甚至神经细胞分化， 已成为骨组织工程的理想种子细胞。骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins， BMP）属于TGFβ超家族成员， 是骨组织工程中应用最广泛的信号蛋白， 其中BMP2是最重要的成骨形成调控因子。而碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， FGF2， bFGF）也是软骨、 骨生长和分化的一种主要调控因子， 在骨的生长和发育中起到一定的作用。然而， 在对大鼠、 小鼠、 兔、 人等骨髓基质细胞、 间质干细胞向成骨细胞分化的研究中， BMP2和FGF2所起的作用， 结果不甚一致［1-4］。我们用外源性BMP2和FGF2刺激小鼠来源， 经纯化和鉴定后的MSCs， 观察BMP2和FGF2对MSCs向成骨细胞方向分化的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 C57BL/6J 小鼠50只(每次实验使用5只， 体质量18~26 g)， 购于美国Jackson实验室。每只笼饲养3~5只， 标准啮齿类动物饮食， 动物的处理和饲养均遵循美国NIH指南。倒置相差显微镜（Axiovert35， Zeiss， Germany）; 多功能分光光度计（VICTOR3TMV， PerkinElmer）; 扫描仪（Cannon， USA Inc）; 荧光定量PCR仪（MJ Research）; OneStepTMNBT/BCIP溶液（Pierce， Rockford， IL）; TRIzol试剂（Inritrogen 公司）; Taq man 逆转录酶试剂盒和SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）; BMP2(PEPRO TECH公司); FGF2(RD公司); 硝酸银溶液（Fluka）; 其余所有化学试剂均购于美国 SigmaAldrich公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠MSCs的体外分离、 扩增、 纯化和鉴定 按

参考文献

［6］的方法进行。

　　1.2.2 MSCs的成骨细胞诱导培养 取体外培养扩增的第4代MSCs， 以1×104/cm2的MSCs 细胞密度种植在96孔板上培养， 共分3组， 每组3个培养孔， OS对照组: 培养第2天加入成骨细胞诱导培养液（osteogenic media， OS）诱导（DMEM， 20 mL/L胎牛血清， 5 mmol/L β甘油磷酸， 50 μmol/L 抗坏血酸）， OS+BMP2诱导组: 在OS基础上再加入100 μg/L BMP2。OS+FGF2诱导组: 在OS基础上再加入0.5 nmol/L FGF2， 持续诱导， 隔日换液。7 d后， 进行碱性磷酸酶(ALP)染色和ALP活性测定。14 d 或21 d后对于钙沉积用von kossa 染色或/和茜素红（Alizarin Red S， ARS） 染色鉴定。同时， 以同样密度的相同的MSCs接种在6孔培养板上培养， 按上述方法分组， 诱导7 d后， 收集细胞， 提取RNA， 作逆转录荧光定量PCR 检测Runx2/cbfa1， ALP， collagen1， osteocalcin的表达量。

　　1.2.3 ALP染色 用无磷酸钙的PBS冲洗细胞3次后， 40 g/L多聚甲醛室温固定 30 min， 双蒸水冲洗3次后， 用 OneStepTM NBT/BCIP 溶液(PIERCE ) 染色15 min， 双蒸水冲洗3次后， 扫描仪扫描。或者使用ALP染色试剂盒（SigmaAldrich No.86）按说明书步骤操作（略）进行ALP染色。

　　1.2.4 ALP活性测定 细胞用PBS冲洗后， 在0.5 g/L Triton X100反复冻融3次， 细胞裂解物孵育在37℃磷酸盐底物30 min， 加入5 μL 1 mol/L NaOH终止反应， 测定A405值。同时用蛋白浓度作标准化处理。ALP 活性用Sigma单位表示， 1个Sigma单位等于每小时释放1 mol pnitrophenol的酶活性。

　　1.2.5 Von Kossa染色 用无钙镁离子的PBS冲洗细胞后， 40 g/L多聚甲醛室温固定 30 min， 用 50 g/L硝酸银溶液在暗室中染色30 min， 用水轻轻冲洗后， 在紫外光下照射30 min， 用扫描仪扫描。对于细胞钙的沉积， Von Kossa染色成黑色， 没有钙的沉积则不显色。

　　1.2.6 ARS染色 用无磷酸钙的PBS冲洗细胞3次后， 用700 mL/L冰乙醇固定细胞1 h， 用水冲洗后， 用 40 mmol/L ARS 溶液 (pH4.2) 室温下染色10 min， 用水冲洗5次后， 再用 PBS洗15 min以洗脱非特异性染色， 染成红色的细胞为成骨细胞。定量分析时， 用10 mmol/L， pH7.0磷酸盐配制的100 g/L cetylpyridinium chloride (CPC) 在室温孵育15 min， 溶解下来的染料通过测定A570值来定量。

　　1.2.7 RNA提取以及实时荧光定量 PCR RNA的分离提取， 按TRIzol试剂说明书进行。按Taq Man试剂盒要求， 2 μg RNA被逆转录成cDNA， PCR反应条件: 95℃ 45 s， 94℃ 45 s， 50℃ 45 s， 72℃ 90 s， 35个循环， 72℃延伸10 min。用SYBR Green Mater Mix 试剂检测待测的基因的mRNA水平， 共重复检测3次， mRNA水平用βactin 作内对照标化， 基因的表达用△△Ct法定量分析［7］。PCR引物序列见表1。 表1 PCR 引物序列

　　1.2.8 统计学分析 实验数据均以x±s表示， 显著性检验采用双侧检验， P＜0.05表示有统计学意义， 所有结果计算采用SPSS10.0 进行检验分析。

　　2 结果

　　2.1 MSCs形态学改变 相差倒置显微镜下观察， 纯化和鉴定后的MSCs呈长梭形或椭圆形， 类似成纤维细胞， 传代培养时， 约3 h开始贴壁， 约3 d， 细胞增殖， 数量增多， 5～7 d进入对数生长期， 细胞生长速度明显增快， 呈单层贴壁生长。在OS+BMP2诱导组诱导培养3～4 d后， 细胞形态由长梭形或椭圆形变成多角形或肥硕梭形， 而OS+FGF2诱导组的细胞形态改变不明显。

　　2.2 BMP2诱导后ALP染色、 ALP活性、 钙沉积和基因表达水平的测定 MSCs在OS以及OS+BMP2诱导7 d后， 进行ALP染色发现: OS+BMP2诱导的细胞染色呈紫蓝色， 颜色比OS对照组更深（图1A）。ALP活性测定显示: OS诱导的MSCs细胞ALP活性为(0.47±0.02) nmol/（μg·min）， OS对照组为(0.36±0.01) nmol/（μg·min）， 两者相比有统计学意义（P＜0.05）。OS诱导 21 d后， 对于细胞钙的沉积， Von Kossa染色成黑褐色， OS+BMP2诱导组比OS对照组更加明显（图1B）。进行ARS染色细胞钙的沉积为橘红色（图1C）， 定量分析发现: OS+BMP2诱导组的A570值为1.29±0.17， OS对照组为0.45±0.05， 两者相比有统计学意义（P＜0.05）。在OS以及OS+BMP2诱导7 d后， 收集细胞提取总RNA， 采用逆转录荧光定量PCR法检测成骨细胞标志性基因ALP， Runx2/cbfa1， collagen1， osteocalcin， 得出OS+BMP2诱导组均比OS对照组显著性增高（P＜0.05， 图2）。

　　2.3 FGF2诱导后ALP染色、 ALP活性、 钙沉积和基因表达水平的测定 OS以及OS+FGF2诱导7 d后， 进行ALP染色发现: OS+FGF2诱导的细胞染色呈红色， 颜色比OS对照组略深（图3A）。ALP活性测定显示: OS+FGF2诱导的MSCs细胞ALP活性为(0.39±0.007) nmol/（μg·min）， OS对照组为(0.35±0.017) nmol/（μg·min）， 两者相比有统计学意义（P＜0.05）。OS诱导14 d 后， 细胞钙的沉积， Von Kossa染色成黑褐色， OS+FGF2诱导组比OS对照组较明显（图3B）。在OS及OS+FGF2诱导7 d后， 收集细胞提取总RNA， 采用逆转录荧光定量PCR法检测成骨细胞标志性基因ALP、 Runx2/cbfa1、 collage1和osteocalcin， 得出OS+FGF2诱导组均比OS对照组增高， 均有统计学意义（P＜0.05， 图4）。图1 MSCs在 OS和OS+BMP2诱导培养后， 分别行ALP染色（A）， Von Kossa染色（B）和ARS染色（C）

　　3 讨论

　　在MSCs体外诱导分化的研究中， 细胞来源多选用人、 兔、 大鼠和小鼠的骨髓基质细胞， 然而骨髓基质细胞为混合细胞， 包括成纤维细胞、 上皮样细胞、 单核巨噬细胞、 外膜网状细胞等。因此在诱导实验时， 骨髓基质细胞中有多少数量的MSCs向成骨细胞方向分化不得而知， 因此不同实验条件下所得出的实验结果往往差别较大。然而小鼠MSCs的获得相对于大鼠和人的MSCs更加困难， 特别是MSCs无特异性免疫表型， 纯化的方法多种多样， 获得形态一致、 具有多向分化潜能、 生物学稳定的MSCs比较困难， 所以多数实验选用基质细胞而不是MSCs。但是本研究已经获得了高质量的MSCs， 为体外进行诱导分化的研究提供了很好的细胞模型， 其研究结果应该更有价值。

　　BMP2作为TGFβ超家族成员， 是一种重要的成骨调节因子， 有很强的促进成骨细胞分化的功能， 并表达特异性的成骨细胞产物。ALP和钙含量是成熟的成骨细胞的标志之一， 其活性的高低反映了成骨细胞的成熟程度。Runx2/cbfa1在成骨细胞的分化成熟以及骨细胞外基质蛋白的基因表达中起重要作用， 而Collagen1则是成骨细胞合成的特异性胶原蛋白， 其构成骨有机基质的90%， 其含量的多少反映了成骨细胞的成熟状况。当体外培养的细胞融合后， 细胞外基质沉积往往伴随着成骨细胞特异性基因的表达， 如Runx2/cbfa1、 ALP、 Collage1、 osteocalcin等， 其中osteocalcin被认为是成骨细胞分化的后期标志， 和成骨细胞的成熟密切相关。在不同来源的骨髓基质细胞众多的诱导成骨细胞研究中， 所得出的结果不甚一致［1， 2］， 这可能与细胞来源、 骨髓基质细胞的混杂性， 细胞来源动物的年龄、 性别、 健康状况， 以及实验所用细胞因子的浓度等因素有关。本实验在OS基础上， 加入100 μg/L BMP2诱导MSCs分化， 数天后细胞形态由长梭形或椭圆形逐渐圆变肥， 细胞突起增多， 部分成多角形， 7 d 检测ALP染色加深， ALP活性明显升高， 成骨细胞的特异性表达基因的mRNA水平也明显升高， 21 d 行Vonkassa或ARS染色显示钙含量明显增加， 说明BMP2在体外可以促进MSCs向成骨细胞方向分化， 该结论和Maegawa［1］、 Varkey等［2］结论基本一致。

　　FGF2是一种肝素黏合多肽， 通过细胞膜特异性受体结合发挥作用， 具有多种生物活性， 包括影响细胞黏附、 增殖与分化功能。成骨细胞表面存在FGF受体， 故当FGF2与成骨细胞表面受体相结合后， 促进骨细胞和类骨细胞的有丝分裂， 同时对成骨细胞的表型特征和细胞外基质的基因表达发挥调控作用。然而在FGF2诱导骨髓基质细胞的分化实验中， 结果也不一致［2-5］， Varkey 等［2］认为在没有地塞米松只有FGF2诱导时， 不能刺激成骨细胞标志性基因生长， 但能增加ALP阳性克隆数， 低浓度（10 μg/L）可以刺激骨髓基质细胞钙结节形成， 而高浓度FGF2可能直接抑制成骨细胞分化的能力。但 Zhang等［4］研究认为无论低浓度或高浓度短时刺激均可增加小鼠ALP克隆数和克隆大小， 以及结节的形成， 而地塞米松并非必需。在本研究条件下， 0.5 nmol/L FGF2诱导7 d 后， 不仅ALP染色加深， ALP活性升高， 成骨细胞的特异性表达基因的mRNA水平也升高， 14 d 行Vonkassa染色显示钙含量增加， 说明FGF2在体外也可以促进MSCs向成骨细胞方向分化， 该结论和Zhang等［4］结论相一致。尽管FGF2刺激不仅对细胞形态的改变不明显， 而且ALP活性升高， 成骨细胞的特异性表达基因的表达量的升高， 钙含量增加都不如BMP2明显， 但在一定程度上是促进MSCs向成骨细胞分化的。

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