淫羊藿甙对小鼠T淋巴细胞体外中期和晚期活化的影响

　　　　 作者：滕菲， 曾耀英*， 黄秀艳， 杨志， 姚满林， 宋兵， 李林

【摘要】 目的: 研究淫羊藿甙（ICA）对刀豆蛋白A（ConA）刺激的小鼠T淋巴细胞体外中期和晚期活化的影响。方法: 采用流式细胞术（FCM）结合双色荧光抗体染色技术分别检测中期和晚期活化标志CD25和CD71分子的表达; 取中期活化的细胞上清， 利用LuminexTM100分析上清中IL2、 IL4、 IL10、 TNFα、 IFNγ的含量变化。结果: ICA在终浓度0.3、 1.5、 3.0 μmol/L时明显抑制CD25的表达而对CD71没有明显影响; 下调Th3型细胞因子及上调Th1型细胞因子的分泌量， 但没有剂量依赖效应。结论: ICA下调CD25、 IL2和Th3型细胞因子水平， 抑制T细胞活化， 同时有一定程度的促进细胞免疫反应， 因此ICA可能具有双向调节免疫平衡的作用。

【关键词】 淫羊藿甙; T淋巴细胞; CD25; CD71; 流式细胞术

　　淫羊藿甙（Icariin， ICA）是中药淫羊藿的主要活性成分， 它具有广泛的药理和生物活性作用［1］。张逸凡等［2］的研究表明: 淫羊藿总黄酮对巴豆油所致小鼠耳肿胀及其他炎症有显著的抑制作用。刘铁汉等［3］利用放射免疫测定方法研究淫羊藿甙及其肠菌代谢产物对炎症性细胞因子（IL6、 IL8、 IL1α、 TNFγ等）均有特异的抑制作用。但在淫羊藿甙对小鼠T淋巴细胞的活化以及细胞因子释放的影响方面的研究很少。本研究中我们探讨了ICA对T淋巴细胞的中期和晚期活化的作用， 并检测了细胞因子水平。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级BALB/cJ(H2Kd ， IAd ， 以下简写为BALB/c)近交系小鼠， 雄性， 8~10周龄， 体质量18~22 g， 购自广东省实验动物中心。淫羊藿甙（ICA）购自湖南九汇现代中药有限公司; 刀豆蛋白A（ConA）、 L谷氨酰胺（glutamine， Gln）、 β二巯基乙醇（2 Mercaptoethanol）， 均购自美国Sigma公司; RPMI1640培养基、 胎牛血清( fetal bovine serum， FBS)为美国GibcoBRL公司产品; 抗小鼠CD3FITC (fluorescein isothiocyanate， 异硫氰酸荧光素)、 CD25PE (phycoerythrin， 藻红蛋白)、 CD71PE单克隆抗体(mAb)购自美国BDPharMingen公司。Beadlyte Mouse MultiCytokine Detection System(IL2、 IL4、 IL10、 TNFα、 IFNγ) 购自美国Upstate公司。FACSCalibur流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。LuminexTM100为XMAP TECHNOLOGY公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠淋巴细胞悬液的制备 将BALB/cJ小鼠断髓处死， 无菌分离小鼠颈部、 双侧颌下、 锁骨下、 腋窝、 腹股沟浅淋巴结及肠系膜淋巴结， 在盛有预冷的PBS的无菌平皿中， 去掉被膜， 200目尼龙网过滤， 收集细胞， 用冷的PBS洗涤细胞2次（250 g， 5 min）后， 用PBS重悬， 得到淋巴细胞悬液。

　　1.2.2 MTT法测定药物对T细胞毒性 将1.2.1中的淋巴细胞悬液用RPMI1640完全培养液（含100 mL/L FBS、 2 mmol/L L谷氨酰胺、 5 μmol/L β二巯基乙醇、 1×105 U/L青霉素、 100 mg/L链霉素)洗涤2次(250 g， 5 min) ， 重悬于RPMI1640完全培养液中， 吹匀并计数， 调整细胞悬液密度为2×109/L， 接种于96孔板， 每孔190 μL。实验共分6组: blank组（空白组， 只加培养基）， control组(对照组， 只加细胞悬液)， 0.3 μmol/L ICA组， 1.5 μmol/L ICA组， 3.0 μmol/L ICA组， 6.0 μmol/L ICA组。每孔定容至200 μL体系。在37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养24 h。然后每孔加5 mg/L的MTT各20 μL， 在培养箱中避光染色4 h后300 g离心5 min， 将上清倒净， 再每孔加100 μL DMSO， 振荡器上振荡10 min， 酶标仪490 nm检测A值。计算药物对细胞的毒性可用以下公式: 细胞存活率=［（药物组A值-空白组A值）/（对照组A值-空白组A值）］×100%。

　　1.2.3 T细胞CD25表达测定 采用直接免疫荧光标记法染色， 接种方法同1.2.2。实验共分5组: 对照组， ConA组， ConA+0.3 μmol/L ICA组， ConA+1.5 μmol/L ICA组， ConA+3.0 μmol/L ICA组。加设单加药1.5 μmol/L ICA组作为阴性对照。每孔定容至200 μL体系。在37℃、 50 mL/L CO2培养箱预孵4 h使药物充分作用， 然后加入刺激剂ConA（终浓度5 mg/L）， 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养24 h后取上清置于-80℃并收集细胞， 离心， 弃上清， 重悬于50 μL PBS， 按每1×106个细胞加入1 μg抗小鼠CD3FITC、 CD25PE mAb， 混匀后室温下避光放置30 min， PBS洗涤2次， 重悬于300 μL PBS中， 立即上流式细胞仪检测。

　　1.2.4 T细胞CD71表达测定 接种、 分组和药物孵育方法同1.2.3。加入ConA（终浓度5 mg/L）， 在37℃、 50 mL/L CO2培养箱培养30 h后取上清并收集细胞， 离心， 弃上清， 重悬于50 L PBS， 按每1×106个细胞加入1 μg抗小鼠CD3FITC、 CD71PE mAb， 混匀后室温下避光放置30 min， PBS洗涤2次， 重悬于300 μL PBS中， 立即上流式细胞仪检测。

　　1.2.5 T细胞中期活化细胞因子检测 将1.2.3中的细胞上清液从-80℃冰箱中取出， 置于25℃室温溶化30 min待测。取96孔板， 向板中待测孔加 25 μL 洗液， 湿润滤膜， 抽滤; 吸取血清标本或标准品50 μL加入96孔检测板， 同时加入 25 μL 捕获微球溶液 (为五种捕获微球混合产物)， 轻微振荡， 室温、 避光、 孵育2 h; 加入25 μL报告分子溶液 ， 轻微振荡， 室温、 避光下在微振荡器上孵育1.5 h; 加入25 μL PE标记亲合素溶液， 轻微振荡， 室温、 避光下在微振荡器上孵育30 min; 加入25 μL终止反应溶液， 轻微振荡， 室温、 避光下在微振荡器上孵育5 min， 使用LuminexTM100仪检测。标准曲线制定: 使用upstate公司的Beadlyte Mouse MultiCytokine Detection System 1 (IL2、 IL4、 IL10、 TNFα、 IFNγ)试剂盒中的细胞因子标准品用稀释液按照梯度法稀释为1∶1、 1∶3、 1∶27、 1∶81、 1∶243、 1∶729 7个浓度及稀释液作为空白对照， 制备细胞因子标准曲线。

　　1.2.6 FCM检测及分析 所有样品经FACSCalibur流式细胞仪获取和CELLQuest软件分析， 其中FITC为荧光1（FL1）通道， PE为荧光2（FL2）通道。每管样品检测6000个细胞， 获得的数据用CELLQuest进行分析。

　　1.2.7 统计学分析 全部数据使用Excel和SPSS10.1做统计学处理， n为样本数， 数据以x±s表示， 两组间的比较采用配对t检验。

　　2 结果

　　2.1 药物对T细胞的毒性 与药物共培养24 h后， 加药组吸光值都低于对照组（P&<0.01， 表1）， ICA在6.0 μmol/L时存活率也有72.06%， 因此， 药物对T细胞的作用不是由于毒性引起的。 表1 MTT测定ICA对T淋巴细胞毒性

　　2.2 ICA对T细胞CD25表达的影响 小鼠T细胞静息状态下很少表达CD25分子， 经ConA刺激24 h后， CD25表达明显增加（图1A、 表2）， 6次试验统计结果显示， 药物组对活化有所抑制， 并随着ICA剂量的增加而抑制增加。单加药1.5 μmol/L ICA组与对照组差异没有统计学意义。此外， ICA组CD3+CD25+T淋巴细胞的平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity， MFI）比ConA刺激组有所下降， 并有一定的剂量依赖趋势。提示表达CD25分子的T淋巴细胞数量和单个T细胞表面CD25的分子密度均有所下降。图1A是其中一次试验结果图。

　　2.3 ICA对T细胞CD71表达的影响 细胞培养30 h后， 静息状态也会少量表达CD71分子， 但ConA刺激组均能达到70%以上（图1B、 表2）， 6次试验结果统计， ICA对于T细胞晚期活化标志CD71分子的表达没有明显的作用， MFI也没有明显差别。图1B是其中一次试验结果图。

　　2.4 ICA对T细胞分泌细胞因子的影响 LuminexTM100检测的6组试验结果显示（表3）， 对照组细胞因子分泌量极少， 基本为零， 而ConA刺激组的细胞因子含量明显增加， 这与上文2.2中的中期活化结果一致。ICA明显上调Th1型细胞因子中IFNγ， TNFα 的分泌量， 但下调IL2的含量， 同时下调Th3型细胞因子IL10和IL4， 但均没有显著的剂量依赖性关系。图1 ICA对ConA刺激T细胞表达CD25和CD71的影响（以其中一次试验为例）表2 ICA对ConA刺激T细胞表达CD25和CD71的影响 表3 ICA对T细胞中期活化分泌细胞因子的影响

　　3 讨论

　　同种异体移植产生免疫排斥反应主要是通过T细胞依赖的机制所介导的， 包括细胞因子的表达、 T细胞增殖和克隆扩增以及T细胞引起的抗体介导的一些排斥反应。现在的免疫抑制技术一般是通过减少或调整T细胞数量， 阻断T细胞信号通路和增殖， 或干扰T细胞进入移植物和受伤组织［4］。可见T细胞在移植免疫中占有重要地位。

　　在静止期T细胞仅表达中亲和力的白介素2受体IL2Rβ、 γ链， 激活后与CD25即IL2Rα链结合形成高亲和力IL2R， 并分泌IL2。通过自分泌和旁分泌作用， IL2与T细胞表面IL2R结合， 介导T细胞活化。ConA刺激的T细胞活化是通过与TCR/CD3复合物的识别， 激活PLCγ活化途径。有文献报道， antiIL2 receptor (即antiCD25)多克隆抗体能够延长同种异体移植物的存活率［5］， 可见下调CD25的表达对于抑制免疫排斥反应及炎症反应是有很大意义。本研究以CD25分子作为T细胞中期活化的标志， 结果ICA下调CD25分子的表达， 而在检测细胞因子的结果中， IL2明显下降， 与中期活化的结果相一致， 但ICA的具体作用机制还不清楚。

　　CD71分子即转铁蛋白受体， 是一种细胞膜相关糖蛋白， 它参与控制细胞从转铁蛋白上摄入铁离子［6］。CD71在静息的淋巴细胞上表达水平很低， 但在受到抗原刺激后， 细胞活化进入G1期， IL2产生信号， 通过AP1/CREB (cyclic AMP response element binding)调节CD71基因的转录， 并且通过诱生铁调节蛋白来保持CD71 mRNA的稳定［6-9］。它的表达是T细胞活化的晚期标志， 本实验中ICA对活化的T细胞CD71分子无明显作用， 而细胞因子实验中显示ICA可下调IL2的产生， 提示ICA作用机制比较复杂， 在信号通路方面还有待于进一步研究。

　　T细胞因子可分为Th1型细胞因子和Th3型细胞因子， 前者包括IL2、 IFNγ、 TNFα和TNFβ等炎症细胞因子， 介导细胞免疫、 细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化以及迟发型超敏反应。后者包括IL4、 IL5、 IL6、 IL10和IL13等抗炎细胞因子， 介导体液免疫、 B细胞和嗜酸性粒细胞的活化以及IgE的生成。本实验ICA上调Th1型细胞因子中IFNγ、 TNFα的分泌量， 同时下调IL2和Th3型细胞因子IL10、 IL4， 推测ICA可能通过上调IFNγ直接活化巨噬细胞， 分泌TNFα激活内皮细胞分泌粘附分子以粘附巨噬细胞和淋巴细胞， 而在淋巴细胞活化方面却有一定的抑制作用， 避免过度活化以保持细胞免疫的平衡; 同时在体液免疫方面， 推测是ICA上调了IFNγ， 从而抑制了Th3型细胞活化， 抑制了IL10、 IL4的产生。

　　还有研究显示一定浓度的ICA可以提高淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）和NK细胞的活性， 提示ICA可以应用于过继免疫疗法， 因为ICA的加入减少了IL2和LAK细胞引起的毒副作用［10］。总之， ICA可能具有双向调节免疫平衡的作用， 具体作用的机制和靶点尚不清楚， 有待于进一步探索。

参考文献

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