食管癌组织微环境对树突状细胞的影响

　　　　 作者：路静， 刘康栋， 赵明耀， 杨洪艳， 黄幼田， 秦珍珠， 白睿华， 董子明

【摘要】 目的: 探讨食管癌组织匀浆上清液体外模拟肿瘤微环境对人树突状细胞（DC）分化发育的影响， 揭示肿瘤免疫逃逸机制， 为DC疫苗的应用提供理论基础。方法: 制备新鲜食管癌及癌旁组织匀浆上清液， ELISA检测其VEGFA含量。密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞， 含rhGMCSF和rhIL4 RPMI1640培养液诱导DC， 第2天在继续诱导DC基础上设食管癌匀浆上清组、 癌旁匀浆上清组、 VEGFA组， 均隔天半量换液， 第4天加入食管癌细胞株EC9706抗原， 第6天加入脂多糖， 第8天收集各组细胞。观察DC形态， 流式细胞术(FCM)检测免疫表型， RTPCR检测CD1a表达， CCK8检测T细胞增殖率及杀伤率。结果: 食管癌组织匀浆上清VEGFA含量［(0.987±0.319) μg/L］明显高于癌旁［(0.152±0.105) μg/L， P&<0.05］; 食管癌匀浆上清组细胞形态明显受到抑制， CD86分子阳性率（%）与正常DC相比由69±8降为42±11、 CD1a由56±12降为27±12、 CD11c由21±13降为18±13（P&<0.01）， CD1a基因几乎无表达， 刺激T细胞增殖率（%）由112.5±7.2降为70.2±3.5（P&<0.01）， 杀伤率（%）由62.4±0.6 降为46.8±1.6（P&<0.01）; 癌旁匀浆上清液组、 VEGFA组结果与正常DC组无统计学意义。结论: 食管癌组织匀浆上清液所模拟的微环境对DC的诱导分化及其功能有明显的抑制作用， 在该抑制作用中VEGFA并不起主要作用。

【关键词】 食管肿瘤; 树突状细胞; 匀浆上清; 混合淋巴细胞反应; 细胞毒性T细胞

　　我国是食管癌高发区， 食管癌死亡率仅次于胃癌居第2位， 食管癌的发生以及防治成为研究的热点。树突状细胞（dendritic cell， DC）是专职抗原提呈细胞， 对于免疫反应的启动、 进展以及免疫耐受的诱导起至关重要的作用［1， 2］。然而在大多数肿瘤患者中， 往往并不能产生DC介导的有效抗原提呈［3］。本研究小组及国内外其他学者应用体外大量扩增DC， 然后用肿瘤抗原冲击后回输患者治疗肿瘤， 取得一定效果［4-6］。研究肿瘤微环境下DC的功能， 可更好地反映宿主的抗瘤免疫状态， 了解其免疫逃逸机制。我们在体外以食管癌组织匀浆上清液模拟肿瘤微环境， 探讨其对DC形态、 表型及功能的影响及VEGFA在其中的作用， 为研究DC介导的肿瘤免疫治疗在食管癌患者中应用提供一定的理论基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 重组人白细胞介素4(rhIL4)、 重组人白介素2（rhIL2）购自Peprotech公司; 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）购自厦门特宝生物公司; 淋巴细胞分离液（Ficoll400， 1 077 g/L）和胰蛋白酶购自天津TBD公司; 完全培养基包括: RPMI1640购自美国Gibco公司， 人血清来自健康捐献者自体血清， 青链霉素各10万U/L; FITC标记的CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR单克隆抗体（mAb）购自美国BD公司; RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司; TRIzol 购自美国Invitrogen公司; 活细胞计数试剂盒CCK8(cell counting kit8)购自日本同仁化学研究所; 人VEGFA ELISA试剂盒购自Bender MedSystems公司。人食管癌细胞株EC9706由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室馈赠; 外周血来自健康成人献血者， 晨起空腹抽取肘静脉血。

　　1.2 方法

　　1.2.1 食管癌标本采集及匀浆制备 取术前无化疗、 放疗史患者手术切除的食管癌组织及距离癌组织5 cm以外的癌旁组织各15例， 病理组织类型均为鳞癌， 无淋巴结转移。标本存放于液氮罐， 用于肿瘤组织匀浆制备。将食管癌及癌旁组织从液氮罐取出， 缓慢复温。称取癌及癌旁组织各200 mg， 浸于青霉素、 链霉素(浓度均为50万U/L)的生理盐水中20 min， 加入1 mL生理盐水， 调整匀浆浓度为200 g/L， 用组织匀浆研磨器缓慢进行组织研磨， 4 000 r/min， 30 min， 离心2次， 弃去下层沉淀， 留取上清液备用， 保存于-20℃冰箱。

　　1.2.2 双抗体夹心ELISA法检测食管癌及癌旁组织匀浆上清液VEGFA蛋白水平 按人VEGFA ELISA试剂盒说明书要求进行具体操作。VEGFA标准品依次倍比稀释并设复孔， 每份癌及癌旁匀浆上清均设1复孔对照。应用SUNRISE酶标仪在波长450 nm条件下， 测各孔吸光度， 取平均吸光度为该样品的吸光度(A)值。根据VEGFA标准品浓度与吸光度的线性回归关系， 绘制出标准曲线， 由A值计算出每份匀浆上清中VEGFA的浓度。

　　1.2.3 食管癌EC9706全细胞抗原的制备 常规培养并收集EC9706细胞， PBS洗2遍， 调密度为1×1010/L的细胞悬液， 置入EP管中， 超声破碎法制备抗原: 时间3 min， 脉冲4 s， 振幅1。13 000 r/min， 30 min， 4℃离心收集上清液， 过滤， 按照Bradford蛋白质定量法制作标准曲线， 测定抗原浓度。-20℃冻存备用。

　　1.2.4 人外周血T淋巴细胞的分离及DC的诱导 方法参照文献［7］， 稍作修改: 抽取健康成人新鲜外周血50 mL、 肝素抗凝、 生理盐水稀释后， 与淋巴细胞分离液以2∶1的比例缓慢加入离心管， 1 500 r/min， 25 min离心后， 毛细吸管轻轻吸取白膜层， 生理盐水洗涤3次(1 300 r/min， 8 min)， 获得人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell， PBMC)。以含100 mL/L自体血清RPMI1640调密度为2×109/L种于24孔板， 37℃贴壁3 h， 收集悬浮细胞， 尼龙毛柱法纯化后获得T淋巴细胞， 种于50 mL培养瓶中， 含rhIL2因子的RPMI1640培养基培养， 备用。去除悬浮细胞后的贴壁细胞用含rhGMCSF 100 μg/L， rhIL4 5 μg/L及100 mL/L自体血清RPMI1640培养液诱导培养DC。第2天实验组在上述诱导DC的基础上分组分别添加食管癌匀浆上清200 mL/L、 癌旁匀浆上清200 mL/L、 VEGFA 10 μg/L。隔天半量换液。第4天各组加入EC9706抗原， 第6天加入脂多糖5 μg/L， 第8天收集细胞， 进行形态观察， 免疫表型分析， RTPCR以及混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction， MLR）和体外杀伤反应。

　　1.2.5 FCM检测细胞免疫学表型 分别于培养0 d (PBMC贴壁3 h去除悬浮细胞后)、 8 d， 收集细胞PBS洗2遍。10 g/L多聚甲醛固定5 min， PBS洗1遍。用PBS调细胞密度为1×109/L， 按20 μL/106个细胞加入荧光标记的mAb（0 d细胞检测CD1a、 CD86、 CD11c、 CD80、 CD83及HLADR; 8 d细胞检测CD86、 CD11c及CD1a）4℃冰箱避光孵育30 min后加入PBS 1 mL， 吹打均匀， 1 000 r/min， 离心5 min， 弃去未结合的多余抗体。每管加入1 mL PBS重悬， 2 h内上机检测。

　　1.2.6 RTPCR 各诱导组细胞总mRNA的提取: 弃掉培养液， 用PBS洗2遍， 在24孔板里加入TRIzol 1 mL， 吹打均匀（呈黏稠状）， 室温静置5 min。转入无RNA酶的EP管中， 加225 μL氯仿， 盖帽， 剧烈振荡15~30 s， 室温静置3 min， 4℃， 14 000 r/min， 离心15 min。吸取上清移至新EP管， 加异丙醇0.5 mL， 充分混匀， 4℃， 12 000 r/min， 离心10 min。弃上清， 加DEPC水配制750 mL/L乙醇1 mL， 振荡洗涤沉淀， 4℃， 7 500 r/min， 离心5 min。得到mRNA， 按照一步法RTPCR试剂盒说明书操作， 获得目的基因DNA片段。CD1a引物: (5′primer): 5′GCTGCACTCTGGAAAGGTCT3′(3′primer): 5′CCAAAGCGCAAGACCTATCA3′(扩增片段长度为601 bp); GAPDH基因作为内参照(5′primer): 5′AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG3′， (3′primer): 5′CTTGACAAAGTGGTCGTTGAGG3′（扩增片段长度为915 bp）。

　　1.2.7 CCK8检测致敏DC诱导MLR及特异性CTL对EC9706细胞杀伤效应 （1）致敏DC的获取: DC培养第4天， 各组加入终浓度为100 mg/L EC9706细胞抗原， 第8天收集DC， 即为负载EC9706抗原的DC。（2）MLR: 各组负载EC9706抗原的致敏DC为刺激细胞， 同种自体T细胞为反应细胞， 两者按1∶20比例混合， 以1×104个/孔种于96孔板， 分为对照组（静止T细胞）; DC组（正常DC+T细胞）; 食管癌匀浆上清组（食管癌匀浆上清诱导DC+T细胞）; 癌旁匀浆上清组（癌旁匀浆上清诱导DC+T细胞）; VEGFA组（VEGFA诱导DC+T细胞）。每组设6个复孔， 混合培养72 h， CCK8试剂盒检测T细胞增殖率。（3）致敏DC诱导特异性CTL的产生: 同种自体T细胞与各组致敏的DC按20∶1比例混合培养72 h， 激活为CTL。（4）细胞毒性实验: 将各组CTL和静止T细胞， 按效应细胞∶EC9706为30∶1比例混合， 分为靶细胞对照组（EC9706）; 效应对照组（静止T细胞+ EC9706）; DC组（DC诱导的CTL+ EC9706）; D组: 食管癌匀浆上清组（食管癌匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706）; 癌旁匀浆上清组（癌旁匀浆上清组DC诱导的CTL+ EC9706）; VEGFA组（VEGFA组DC诱导的CTL+ EC9706）。设每组6个复孔， 1×104个/孔细胞悬液200 μL种于96孔板， 培养72 h， CCK8法检测对EC9706细胞杀伤率。（5）CCK8检测: 加入10 μL/孔的CCK8试剂， 培养2 h， 于酶标仪450 nm处测各组A值， 计算T细胞增殖率和杀伤率。其计算公式如下: T细胞增殖率=实验组A值/静止T细胞组A值×100％; 细胞杀伤率=（效应对照组A值-实验组A值)/靶细胞对照组A值×100％。

　　1.2.8 统计学分析 采用SPSS12.0统计软件， 进行两组OneWayANOVA分析， 以x±s表示。

　　2 结果

　　2.1 ELISA检测食管癌及癌旁组织匀浆上清VEGFA含量 检测15例食管鳞癌及癌旁组织匀浆上清液， 结果显示癌旁匀浆上清组A值0.203±0.089， VEGFA浓度0.152±0.105 μg/L; 癌上清组A值0.897±0.251， VEGFA浓度0.987±0.319 μg/L， 两组比较P&<0.05， VEGFA含量有统计学意义。

　　2.2 形态学观察 PBMC去除悬浮细胞后， 镜下观察细胞贴壁， 体积小。诱导2 d， 部分贴壁细胞变形， 伸出小突起; 第4天， 正常DC组细胞表面突起更加明显， 并且交织在一起， VEGFA组与癌旁匀浆上清组细胞形态与正常DC组相似， 而食管癌匀浆上清组细胞形态变化较小， 仅有个别细胞伸出突起， 细胞体积小于正常DC组细胞; 第8天， 正常DC组、 VEGFA组与癌旁匀浆上清组细胞逐渐增大变圆， 高倍镜下细胞周围可见毛刺状突起， 部分细胞悬浮， 呈成熟形态， 而食管癌匀浆上清组大圆细胞少， 呈发育迟缓状态（图1）。

　　2.3 FCM检测细胞相关表面抗原 分离PBMC， 贴壁3 h， 去除非贴壁细胞， 检测DC诱导前PBMC相关抗原阳性率（%）CD80 13.92±3.60、 CD83 9.56±3.91、 CD1a 18.86±2.23、 HLADR 22.62±3.31、 CD86 38.64±4.05、 CD11c 7.31±2.67。第2天各组分别加入食管癌匀浆上清、 癌旁匀浆上清、 VEGFA， 诱导7 d后有关细胞表面抗原表达见表1。

　　2.4 RTPCR检测CD1a基因表达 正常DC组目的基因CD1a（601 bp）的表达较强， 食管癌匀浆上清组该基因基本无表达， VEGFA组与癌旁匀浆上清组CD1a表达与正常DC组无统计学意义， 内参基因GAPDH（915 bp）各组表达较一致（图2）。 表1 诱导后DC的免疫表型

　　2.5 致敏DC诱导T细胞增殖及其特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤效应 食管癌匀浆上清组诱导的DC刺激T细胞增殖率、 CTL杀伤率均明显低于正常DC组、 癌旁匀浆上清组、 VEGFA组诱导的DC; 而VEGFA组与正常DC组无统计学意义（图3、 4）。图3 各组T细胞增殖率（%）的情况

　　3 讨论

　　DC是体内专职的抗原提呈细胞， 成熟DC具有较强的抗原提呈能力［8］， 肿瘤患者外周血及免疫器官存在一定数量DC， 但肿瘤细胞仍能逃逸机体免疫监视而无限制生长， 这是由于肿瘤组织内的DC基本不成熟或不活跃， 其浸润数量与免疫反应的强弱并无必然相关性， 因此研究的重点转移到了肿瘤局部DC的功能和活性上［9］。

　　本结果显示， 早期未成熟DC， 在食管癌组织匀浆上清液模拟的肿瘤微环境影响下， 细胞形态方面明显落后于正常DC， 在基因水平也基本不表达CD1a， 并且膜表面低表达CD86、 CD11c等共刺激分子， 而这些表面分子的表达是DC 完成其抗原提呈功能所必需的， CD86高表达是DC分化的转折点， 标志着DC具备足够的共刺激能力。已知机体对肿瘤细胞的免疫排斥主要依赖于体内的T细胞， T细胞的激活需要两类信号: 一类是特异的抗原提呈信号， 另一类是非MHC限制的共刺激信号。若缺乏共刺激信号， 则T细胞处于无能状态或凋亡。本实验中食管癌匀浆上清组细胞表面CD1a、 CD11c、 CD86等活化T细胞的第二信号分子表达低下， 说明其不具备足够的共刺激能力， 是功能低下或无功能的DC， 导致T细胞增殖能力明显降低， 体外杀伤EC9706细胞能力也相应减弱。

　　本研究中， 由于DC尚处于未成熟阶段， 食管癌组织匀浆上清液中可能存在抑制DC成熟的因子， 一些文献报道血管内皮生长因子是起到抑制作用的主要因子之一［10， 11］。我们通过检测食管癌及癌旁组织匀浆上清液中VEGFA的含量， 以及设立VEGFA对照组进行研究。ELISA检测食管癌组织匀浆上清液中VEGFA的含量明显高于癌旁组， 似乎VEGFA是导致DC抑制的可能因素， 然而， VEGFA (10 μg/L)组与正常DC组相比细胞形态以及表面标志的表达、 以及功能检测均无明显区别， 表明， 单独VEGFA并没有起到明显抑制DC成熟的作用; 在食管癌组织匀浆上清液中VEGFA含量为（0.99±0.32）μg/L， 远低于VEGFA组含量10 μg/L， 说明食管癌组织匀浆上清液抑制DC过程中VEGFA也不起主要作用， 可能通过IL10等其他因子、 或多因子联合作用而下调DC的有效提呈功能。这些肿瘤相关性DC成熟障碍、 功能受抑， 为肿瘤细胞逃避机体的免疫监视诱导机体对肿瘤的免疫耐受提供了直接的依据。

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