人精子特异性乳酸脱氢酶DNA疫苗的构建及免疫效果的初步研究

　　　　 作者：辛娜， 张朵， 陈平， 涂向东， 吴玉水， 兰风华

【摘要】 　　目的: 构建人精子特异性乳酸脱氢酶 DNA疫苗， 并免疫雌雄两性BALB/c小鼠， 以观察特异性抗体的产生。方法: 采用分子克隆的方法构建pVAX1hLDHC DNA疫苗。双酶切及正反向测序对该DNA疫苗进行鉴定。肌肉注射方法免疫雌雄两性BALB/c小鼠， ELISA和Western blot方法检测小鼠血清中的特异性抗体， 常规病理学方法检测雄性实验小鼠的睾丸组织。结果: 双酶切及正反向测序结果表明: 插入片段的序列以及插入的位置和方向均正确。肌肉注射免疫BALB/c小鼠后可诱导明显的体液免疫反应， 且在雄性实验小鼠中未观察到睾丸炎的发生。结论: 成功构建了具有一定免疫效果的hLDHC DNA疫苗， 为今后进行更深入的研究奠定了基础。

【关键词】 精子特异性乳酸脱氢酶; DNA疫苗; 基因免疫

　　精子特异性乳酸脱氢酶即乳酸脱氢酶C4（lactate dehydrogenase C4， LDHC4）是一种仅存在于鸟类和哺乳动物精子细胞中的乳酸脱氢酶同工酶， 其功能可能与精子的能量代谢和获能有关［1， 2］。鉴于分布上的特异性， LDHC4一直被当作免疫避孕疫苗的候选对象而受到重视［3］。核酸疫苗是继减毒疫苗、 基因工程疫苗之后的第3代疫苗; 与前两代疫苗相比， 具有很多明显优势， 可诱导机体同时产生细胞免疫和体液免疫、 应答持续时间长、 没有潜在致病危险等。本研究我们根据GenBank登陆的人LDHC4序列， 采用分子克隆的方法， 体外获得hLDHC4基因编码序列， 并将其与pVAX1表达载体连接， 构建了DNA疫苗pVAX1hLDHC， 并对其进行了鉴定。将此疫苗通过肌肉注射方法免疫雌雄两性BALB/c小鼠， 检测了小鼠血清中特异性抗体的产生。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人睾丸λTripIEx cDNA文库为美国CLONTECH公司产品; pVAX1真核表达载体为Invitrogen公司产品; 兔网织红细胞体外转录/翻译试剂盒（TNT Quick Coupled Transcription/Translation System）为Promega公司产品; 质粒提取试剂盒为Qiagen公司产品; 福氏佐剂购自Gibco公司; BALB/c小鼠48只， 雌雄各半， 6～8周龄， 清洁级， 购自中国科学院上海实验动物中心， 合格证号: SCXR（沪）2004-0005， 实验和饲养均在南京军区福州总医院动物实验科进行。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人LDHC4 DNA疫苗的构建及鉴定 以人睾丸λTripIEx cDNA文库为模板， 依据GenBank登录的人LDHC4 mRNA（GI: 187065）全长序列， 设计引物。PCR扩增hLDHC4编码序列全长。上游引物为 5′CCGAAGCTTGCACCATGTCAACTGTCAAGGAGCAGC3′， 带一个HindⅢ酶切位点（下划线）， 下游引物为5′CCGCTCGAGTTAAAATATTAGATCCTTTTGAATATTCC3′， 带一个XholⅠ酶切位点（下划线）， 预期产物大小为1 016 bp。将其与真核表达载体pVAX1连接， 获得DNA疫苗pVAX1hLDHC， 转化入大肠杆菌E.coli DH5α中扩增。提取转化菌中的重组质粒， HindⅢ/XholⅠ双酶切分析插入片段的有无和大小， 将经双酶切鉴定的重组质粒委托上海博亚生物公司测序。以鉴定后的pVAX1hLDHC为模板， 采用兔网织红细胞体外转录/翻译试剂盒， 进行体外转录和翻译。反应体系为: TNT Quick Master Mix 40 μL 、 methionine 1 μL、 pVAX1hLDHC重组质粒4 μL （约2 μg）、 ddh3O 5 μL。混匀， 30℃反应90 min。

　　1.2.2 免疫用DNA疫苗的制备 使用碱裂解法与无内毒素质粒大量提取试剂盒相结合方法提取并纯化重组质粒。方法简述如下: 首先采用传统碱裂解法从1 000 mL过夜培养的转化菌中提取重组质粒， 室温下风干后， 按照试剂盒说明书的步骤重新抽提并纯化。在此过程中去除可能引起实验动物发热等一系列异常反应的内毒素。琼脂糖凝胶电泳以及分光光度法测定质粒的纯度和含量。

　　1.2.3 重组hLDHC4蛋白的制备 将体外获得的hLDHC4编码序列与原核表达载体pET28a(+)连接， 获得重组质粒pET28a（+）hLDHC， 转化入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）， IPTG诱导重组hLDHC4蛋白的可溶性表达， Ni+NTA亲和层析法（按His融合蛋白纯化试剂盒说明书所述方法进行）纯化重组蛋白， SDSPAGE电泳鉴定蛋白质纯度［4］。

　　1.2.4 BALB/c小鼠的基因免疫 BALB/c小鼠42只， 分为4组。 A组为重组蛋白疫苗组， 10只; B组为生理盐水组， 6只; C组为空质粒组， 6只; D组为DNA疫苗免疫组， 20只。每组雌雄各半。在戊巴比妥钠麻醉(50 mg/kg)状态下进行免疫。A组的免疫方式为: 将重组蛋白100 μL (60 μg)加等体积完全弗氏佐剂充分乳化， 于每只小鼠背部皮下分4点注射。4周后将重组蛋白100 μL (8 μg)与等体积不完全弗氏佐剂充分乳化后， 腹腔注射作加强免疫， 4周后再次作加强免疫， 共免疫3次。C、 D组的免疫方式为: 将质粒（空质粒、 重组质粒）用生理盐水调整浓度为1 g/L。免疫前， 于小鼠双腿股四头肌注射5 g/L盐酸布吡卡因100 μL， 24 h后相同部位注射100 μg质粒。每隔3周加强免疫1次， 共免疫3次。B组用等体积生理盐水代替质粒溶液， 免疫方式同C、 D组。

　　1.2.5 小鼠血清中hLDHC4抗体的ELISA检测 每次免疫前均从小鼠眼眶后静脉采血0.1～0.3 mL。4℃过夜， 8 000 r/min离心10 min收集血清， -20℃保存备用。以30 mg/L重组蛋白为抗原， 50 μL/孔包被反应孔， 4℃过夜。50 μL (40 g/L)BSA封闭液37℃封闭1 h。将各组小鼠血清1∶200稀释后， 50 μL/孔加入到反应孔中， 37℃反应1 h， 加入1∶20 000稀释的羊抗鼠IgGBiotin 结合物， 37℃反应1 h， 加入50 μL 1∶50 000稀释的HRPStreptavidin， 37℃孵育1 h， 加入新鲜配制的四甲基联苯胺底物使用液50 μL， 37℃避光显色5～10 min。加50 μL 2 mol/L h3SO4终止反应， 酶联免疫检测仪在主波长450 nm与次波长650 nm处测吸光度（A）值， 以确定各组血清中的抗体滴度。
　　
　　包被缓冲液将重组蛋白作一系列稀释（10 mg/L至60 mg/L）后， 按上述方法进行ELISA检测， 小鼠血清使用DNA疫苗组免疫后6周的血清（1∶200稀释）， 以确定血清中的抗体与抗原的关系。

　　1.2.6 小鼠血清中hLDHC4抗体的Western blot检测 将制备的hLDHC4抗原经120 g/L SDSPAGE电泳后， 置Towbin转移缓冲液中平衡15 min， 15 V电压下转移30 min， 取出硝酸纤维素膜置10 g/L BSA中4℃封闭过夜， 加入1∶50稀释的免疫血清， 室温下反应1 h， 加入1∶20 000稀释的羊抗鼠IgGBiotin 结合物， 室温下反应1 h， 加入1∶1 000稀释的HRPStreptavidin， 室温下反应1 h， 加入4氯1萘酚显色液显色5～10 min。

　　1.2.7 小鼠睾丸组织常规病理检查 抽取2只ELISA检测阳性的雄性小鼠， 颈椎脱臼法处死， 摘取睾丸组织， 40 g/L多聚甲醛固定， 常规病理检查。

　　2 结果

　　2.1 hLDHC4 DNA疫苗的制备及鉴定 采用如上所述的PCR方法， 体外获得了hLDHC4编码序列， 将其与pVAX1表达载体连接后获得了重组质粒 pVAX1hLDHC 即DNA疫苗， HindⅢ/XholⅠ双酶切分析显示: 重组质粒可释放1条约1 000 bp的插入片段， 与预期大小一致（图1）; 正反向测序结果表明: 插入片段的序列和方向均正确。每次用于免疫动物的重组质粒经双酶切分析后均在1 000 bp位置出现一条插入片段， 且用分光光度法测定质粒的浓度和纯度时， A260/A280均在1.8左右， 无RNA或蛋白质等杂质污染。

　　2.2 小鼠血清的ELISA检测 以30 mg/L作为抗原包被浓度对各组小鼠血清进行ELISA检测。结果表明: DNA疫苗组和重组蛋白疫苗组的小鼠血清中的抗体随免疫次数的增加， 滴度逐渐升高。而生理盐水组和空质粒组的小鼠血清抗体滴度变化不明显（图2， 重组蛋白疫苗组因免疫时间不同， 图中未显示）。将包被抗原做一系列稀释后， 与1∶200稀释的DNA疫苗组的小鼠血清反应。结果显示， 抗原包被浓度在20 mg/L与50 mg/L之间时， 所测得的A450值随抗原浓度的增加而升高。

　　图1 重组质粒的双酶切分析（略）

　　M: DNA marker; 1: 重组质粒酶切前;　　2: 重组质粒酶切后; 3: 空质粒酶切前;　　 4: 空质粒酶切后.

　　图2 各组小鼠血清中的抗体滴度随免疫次数的变化曲线（略）

　　2.3 免疫血清的Western blot检测 以重组蛋白hLDHC4为抗原检测小鼠血清中的hLDHC4抗体。结果显示: 重组蛋白疫苗组和DNA疫苗组的小鼠血清中含有的待测抗体， 在硝酸纤维素膜上形成特异性条带（图3）， 而生理盐水组和空质粒组的小鼠血清中均未检测到特异性抗体的存在。

　　图3 小鼠血清中hLDHC4抗体的Western blot检测（略）

　　A1: 重组蛋白疫苗组雌性实验小鼠; B1: 重组蛋白疫苗组雄性实验小鼠; C1: DNA疫苗组雌性实验小鼠; D1: DNA疫苗组雄性实验小鼠; A2 和 C2: 空质粒免疫组雌性实验小鼠; B2 和 D2: 空质粒免疫组雄性实验小鼠.

　　2.4 病理检测 常规病理检测结果显示， 雄性实验小鼠的睾丸组织精小管大小正常， 无萎缩、 无基底膜增厚等现象， 无灶状或弥漫性淋巴细胞和浆细胞浸润以及与上述相似的炎症细胞浸润现象。

　　3 讨论
　　
　　DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因直接转移到动物体内， 通过宿主表达系统合成抗原蛋白， 诱导宿主产生免疫应答， 以达到预防和治疗疾病的目的， 目前已在多种疾病的防治研究中显示出巨大的应用潜力［5， 6］。使用DNA疫苗技术进行抗生育研究也取得了突破性进展［7， 8］。在本研究中， 首先采用分子克隆的方法体外获得了hLDHC4编码序列， 并构建了pVAX1hLDHC DNA疫苗。pVAX1是经美国FDA批准的专门用来发展DNA疫苗的载体， 与其他载体相比， 它整合到人染色体中的几率最低。双酶切分析及正反向测序结果均表明: hLDHC4的编码序列已成功插入到pVAX1表达载体中， 且插入片段的序列以及插入的位置和方向均正确。兔网织红细胞体外表达系统可快速鉴定蛋白质的表达。使用该系统鉴定pVAX1hLDHC DNA疫苗的表达活性， 结果表明: 该DNA疫苗在此系统中可指导hLDHC4蛋白表达， 提示此重组质粒在哺乳细胞表达系统中具有指导hLDHC4蛋白合成的功能。以上结果说明本研究已成功构建了hLDHC4的DNA疫苗， 可进行后续实验。
　　
　　我们使用国内外比较公认的肌肉注射途径进行免疫。免疫前24 h用5 g/L盐酸布吡卡因预处理待注射部位， 使肌肉处于再生状态， 这种再生状态的肌肉组织对DNA的吸收增加， 抗原表达量增高， 可刺激机体产生较高水平的抗体［9］。ELISA检测结果表明， pVAX1hLDHC DNA疫苗免疫BALB/c小鼠后， 可诱导小鼠产生明显的体液免疫应答。第1次免疫后3周， 在雌、 雄实验小鼠中均检测到抗体的产生， 此后滴度随免疫次数的增加而升高。生理盐水组和pVAX1空质粒组均未检测到抗体产生。Western blot检测结果也表明， DNA疫苗和重组蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生的抗体具有很高的特异性， 与纯化的hLDHC4蛋白抗原反应后， 可形成特异性的条带。由于 LDHC4对于雄性动物是一种自身抗原， 可诱导自身免疫反应的发生。我们在ELISA检测阳性的雄性实验小鼠中未观察到由于自身免疫反应而引起的睾丸炎现象， 可能是血睾屏障的作用， 这说明pVAX1hLDHC DNA疫苗具有一定的安全性。

参考文献

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　　［2］ Coonrod S， Vitale A， Duan C， et al. Testisspecific lactate dehydrogenase (LDHC4; Ldh3) in murine oocytes and preimplantation embryos［J］. J Androl， 2006， 27(4): 502-509.

　　［3］ Naz RK. Vaccine for contraception targeting sperm［J］. Immunol Rev， 1999， 171(10): 193-202.

　　［4］ 张 朵， 熊永忠， 陈 平， 等. 小鼠乳酸脱氢酶C4在大肠杆菌中的可溶性表达与鉴定［J］. 解放军医学杂志， 2008， 33（2）: 176-179.

　　［5］ 孙树汉， 戴建新， 张平武， 等. 核酸疫苗［M］. 上海: 第二军医大学出版社， 2000: 1-7.

　　［6］ 孙树汉. 影响核酸疫苗应用研究的若干问题［J］. 第二军医大学学报， 2002， 23(4): 353-354.

　　［7］ Shi SQ， Wang JL， Peng JP， et al. Oral feeding and nasal instillation immunization with Microtus brandti lactate dehydrogenase C epitope DNA vaccine reduces fertility in mice via specific antibody responses［J］. Fert Steril， 2005， 84(3): 781-784.

　　［8］ Chang JJ， Peng JP， Yang Y， et al. Study on the antifertility effects of the plasmid DNA vaccine expressing partial brLDHC4′［J］. Reproduction， 2006， 131(1): 183-192.

　　［9］ Hohlfeld R， Engel AG. The immunobiology of muscle［J］. Immunol Today， 1994， 15(6): 269-274.