重组人Jo1自身抗原的克隆、 原核表达及抗原特异性鉴定

　　　　 作者：赵晓瑜， 毕智丽， 吴亦红， 辛海涛

【摘要】 　　目的: 旨在获得高纯人Jo1抗原（即组氨酰tRNA合成酶）。方法: 利用RTPCR从人胎盘总RNA中获得Jo1的编码基因， 并分别用IMPACTCN和pMAL系统的pTYB11、 pMALc质粒， 构建了表达载体， 转化至大肠杆菌ER2566、 BL21。结果: 经筛选与鉴定， 得到阳性重组子诱导表达后均获得Jo1融合蛋白。Western blot显示， 这两种融合蛋白都具有Jo1抗原特异性， 即仅与含Jo1抗体的多肌炎和皮肌炎自身免疫病患者血清反应， 而与正常人以及188例含有其他自身抗体（分别为RNP阳性、 Sm阳性、 Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）的患者血清均为阴性反应。结论: 在两种表达载体中， pMALcJo1的表达量超过菌体蛋白的50％， 而且以可溶性形式存在， 有利于分离纯化， 为临床检测创造了条件。

【关键词】 Jo1; 基因; 表达; 抗原特异性

　　氨酰tRNA合成酶是胞内酶， 由“管家”基因编码， 可在所有组织中表达， 主要催化包括蛋白质合成过程中的氨基酸活化和氨酰tRNA复合物的形成两步反应。人组氨酰tRNA合成酶（HSHRS）还是一类结缔组织病（自身免疫疾病）中的横纹肌弥漫性炎症疾患多肌炎（polymyositis， PM）和皮肌炎(dermatomyositis， DM)的标志性自身抗原［1， 2］， 临床上称之为Jo1， 相对分子质量（Mr）为55 000， 由509个氨基酸组成， 基因全长1 527 bp［3， 4］。因PM和DM患者的血清中含有特异性的抗Jo1抗体， 故Jo1可用于临床鉴别和诊断多肌炎和皮肌炎［5-8］。我们利用基因重组的方法获得重组Jo1自身抗原， 为开发自身抗体的临床检测试剂创造了条件。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒pTYB11、 pMYB5， 大肠杆菌ER2566、 BL21为BioLab公司产品。TRIzol Reagent为Invitrogen公司产品。MMLV Reverse Transcriptase、 T4 DNA Ligase为Promega公司产品， Spe I、 Pst I为TaKaRa公司产品。正常人血清、 Jo1阳性血清和各种结缔组织病阳性血清， 来自北京协和医院、 首都医科大学和天津长征医院， 二抗羊抗人IgGHRP， 由北京生物制品所生产。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组质粒的构建 液氮速冻人胎盘组织， TRIzol法提取总RNA。根据GenBank注册序列X05345， 利用Primer Premier5.0软件设计嵌套引物进行反转录和巢式PCR， 获得Jo1全长基因。Spe I、 Pst I双酶切质粒pTYB11、 pMALc， 并对线性质粒进行去磷酸化， 用T4连接酶将回收的双酶切pTYB11、 pMALc与目的DNA片段进行连接， 获得带有Jo1基因的重组质粒， 应用CaCl2法将重组质粒转化大肠杆菌ER2566、 BL21菌株。

　　1.2.2 重组子的筛选与鉴定 pTYB11和pMALc质粒载体携带有氨苄青霉素抗性基因， 以氨苄终浓度为0.1 g/L配制LB平板初筛转化子。提取转化子质粒， 琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小， 并用质粒作模板进行特异性扩增和双酶切鉴定。利用pTYB11载体自带的正向测序引物以及设计中间引物由上海联合基因科技（集团）有限公司进行全基因测序， 利用BLASTn对测序结果进行序列同源性分析。

　　1.2.3 Jo1基因在大肠杆菌ER2566、 BL21中的诱导表达与产物分析 37℃过夜菌转接后培养至A600为0.8左右， IPTG（终浓度0.3 mmol/L）30℃诱导培养6 h后收集部分菌体， 直接进行SDSPAGE分析， 其余菌体进行超声波破碎（缓冲液: 50 mmol/L TrisHCl， 0.5 mmol/L EDTA， 9 g/L NaCl， 50 g/L甘油）， 分别对上清和沉淀进行100 g/L SDSPAGE。将100 g/L SDSPAGE胶上样品转移到PVDF膜上， 分别用两份Jo1阳性血清、 12例正常人和188例其他自身免疫性疾病患者血清（包括RNP阳性、 Sm阳性、 Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）进行Western blot检测。

　　2 结果

　　2.1 Jo1基因的获得 根据GenBank中的编码人组氨酰tRNA合成酶的mRNA（X05345）的成熟蛋白编码序列， 利用Primer Premier 5.0软件设计嵌套引物: 引物I: 5′ACAGCAGGCGGCTCAAGT3′; 引物Ⅱ: 5′TAACCTCAAATAGTGCCAGTCC3′; 引物III: 5′GACTAGTGCAGAGCGTGCGCCGCTG3′; 引物Ⅳ: 5′GGTGGTCTGCAGTCATGCCAGTCCCACTTCCTTTC3′， 其中引物Ⅲ和引物Ⅳ的5′端分别加了限制性内切酶Spe I、 Pst I酶切位点和保护性碱基。以总RNA为模板， olig (dT) 做反向引物， 反转录第1条链。以反转录产物为模板， 用第一对引物Ⅰ、 Ⅱ进行PCR扩增， 产物长度为1 608 bp; 用第一次扩增产物做模板， 用第二套引物Ⅲ和Ⅳ进行2次扩增， 扩增产物为1 585 bp（图1）。

　　图1 Jo1基因片段的扩增（略）

　　Fig 1 Jo1 gene fragments obtained by RTPCR

　　M: DL 2 000 marker; 1: PCR product using primers I andⅡ(1 608 bp); 2-4: PCR product using primers Ⅲ and Ⅳ(1 585 bp).

　　2.2 表达载体的构建

　　2.2.1 构建pTYB11Jo1和pMALcJo1表达载体 构建后的重组子， 通过抗性筛选、 质粒双酶切、 以及以菌落为模板进行特异性扩增等方法， 鉴定阳性重组子(图2)。

　　图2 阳性重组质粒的鉴定（略）

　　Fig 2 Identification of positive recombinants

　　1， 2， 6: Recombinant plasmids digested with Spe I and Pst I; m: DL 2 000 marker; 3: Jo1 gene fragment; 4: Negative plasmid; 5: Negative plasmid digested with Spe I and Pst I; M: λDNA/Hind Ⅲ.

　　2.2.2 测序及生物信息学分析 利用pTYB11载体自带的intein正向引物、 primer Ⅳ和设计序列中间引物对重组子T3进行DNA测序， 对测序结果进行拼接， 结果得到包括Jo1自起始密码子后第一个碱基到终止密码子下游11个碱基、 长1 538个核苷酸的序列， 添加起始密码子即为得到的全长1 541个核苷酸的序列， 利用BLASTn对测序结果进行序列同源性比较。结果表明， 中国人组氨酰tRNA合成酶基因序列与GenBank中已注册的16个组氨酰tRNA合成酶基因均有较高的相似度。在这些序列来源于， 6个是美国人、 5个法国人、 2个日本人， 还有2个是类人猿， 以及1个黑猩猩的组氨酰tRNA合成酶基因序列。其中与黑猩猩的序列（CR861182）相比有98％相似度; 与人和类人猿的几个全长序列（如BC080514， BC011807， NM_001209， X05345等）相似程度达99％。
　　
　　本研究中提交序列号为AY995220， 与序列NM_002109的比较结果， 共有7个碱基存在差异， 其中4个不影响氨基酸编码， 但第16、 839、 1379位核苷酸的不同导致它们编码的第6、 280、 460位氨基酸种类出现差异: 前两个氨基酸变化是中性非极性疏水氨基酸之间的替换， 第460位氨基酸在NM_001209的蛋白质序列中是中性非极性疏水的Ile， 而在T3序列中则是极性疏水的Thr。

　　2.3 表达产物的分析（SDSPAGE）和纯化 被诱导的pTYB11Jo1重组子表达出Mr为110 000的蛋白产物， 这与预测Mr为55 000的Jo1蛋白与Mr为55 000的intein的融合蛋白大小一致(图3)。经超声破菌， 融合蛋白大多存在于离心后的沉淀中， 说明表达的融合蛋白形成了包涵体。pMALc是一种MBP (麦芽糖结合蛋白， Mr为42 000) 融合蛋白表达载体， 因此pMALcJo1诱导表达出的融合蛋白Mr预测为100 000， 转化子A1、 A2经诱导表达的产物Mr与预测相同; 同时在电转至PVDF膜后用抗MBP抗体检测， 确实获得了Mr为100 000的MBP和Jo1的融合蛋白（图4A）。经发酵、 诱导和超声破菌后电泳表明， 重组蛋白的表达量超过菌体蛋白的50％， 而且存在于上清中。该上清液经MBP的亲和层析载体amylose resin吸附、 洗脱后， 获得到了单一的融合蛋白（图4B）。

　　图3 pTYB11Jo1表达产物分析（略）

　　Fig 3 Analysis of expression products of recombinant pTYB11Jo1(SDSPAGE)

　　M: Protein marker; 1: Cells carrying pTYB11Jo1; 2， 3: Supernate and pellet after centrifigation of lysis of cells carrying pTYB11Jo1.

　　图4 pMALcJo1表达产物的分析（略）
　　
　　Fig 4 Analysis of expression products of recombinant pMALcJo1(SDSPAGE)

　　A: SDSPAGE; 1: Uninduced cells carrying pMALcJo1; 2， 3， 6: Induced cells carrying pMALcJo1; 4: Induced cells carrying pMALc; 5: Uninduced cells carrying pMALc; M: Protein marker; 7， 8: Supernate and pellet after centrifigation of lysis of cells carrying pMALcJo1; 9: Purified fusion protein MBPJo1 by affinity chromatography; 10: BSA; B : Western blot (reaction of expressive protiens with antiMBP antibody): 1: Negative control (pMALc); 2: Positive recombinant (pMALcJo1).

　　2.4 表达产物的抗原特异性分析 利用两份Jo1抗体标准血清， 分别与诱导表达后的pTYB11Jo1、 pMALcJo1重组子进行Western blot， 在表达区带处出现明显条带（图5A、 图6A）。将pTYB11Jo1的表达产物与正常人血清， 以及188例含有其他自身抗体（分别为RNP阳性、 Sm阳性、 Ro/La阳性和RNP/Ro阳性）的患者血清反应为对照， 结果这些血清均无显色带(图5B)。将纯化的pMALcJo1表达产物， 与5例含有抗Jo1抗体血清反应， 明显呈阳性显色（图6B）。将pMALcJo1表达的MBPJo1融合蛋白纯化后， 与5例含抗Jo1抗体血清、 5例正常人血清， 以及12例含有其他自身抗体（分别为RNP阳性， Sm阳性， Ro/La阳性）的患者血清反应， 利用ELISA检测结果具有明显差异（未列数据）， 说明重组子表达的Jo1融合蛋白有很好的Jo1抗原特异性。

　　3 讨论
　　
　　根据对测序结果进行生物信息学分析可知， 组氨酰tRNA合成酶基因在不同人种之间的保守性很高。尽管存在个别碱基位点的突变， 但在临床检测Jo1抗原特异性实验结果说明， 这些氨基酸位点的突变不影响其免疫原性。

　　图5 pTYB11Jo1表达产物的抗原特异性鉴定（略）

　　Fig 5 Identification of Jo1 antigen specificity of expression product of recombinant pTYB11Jo1（Western blot）

　　A: Reaction of products expressed by three recombinants（pTYB11Jo1）with different sera; 13: Normal sera; 4-6， 7-9: Ttwo sera containing antiJo1antibody. B: Reaction of products expressed by recombinants（pTYB11Jo1）with different sera; 1， 8: Serum containing antiJo1 antibody; 2-7: Six sera containing antiRNP/Sm antibody; 9-13: Five sera containing antiRo/La antibody.

　　图6 pMALcJo1表达产物的抗原特异性鉴定（略）

　　Fig 6 Identification of Jo1 antigen specificity of expression product of recombinant pMALcJo1（Western blot）

　　A: Reaction of products expressed by two recombinants (pMALcJo1) with different sera; 1-2: Normal serum; 3-6: Two sera containing antiJo1 antibody. B: Reaction of purified MBPJo1 with different sera; 1-5: Five sera containing anti Jo1 antibody; 6: Normal serum.

　　IMPACT蛋白质纯化系统中的pTYB11质粒是带有自我剪切功能的融合蛋白表达载体， 它含有可以利用巯基（β巯基乙醇、 二硫苏糖醇或半胱氨酸）实现自我剪切的蛋白质内含子（intein）基因， 同时该基因还连有一个几丁质结合蛋白的结构域（CBD）。由于目的蛋白N端第一个氨基酸的种类决定了自我剪切的效率， Jo1 N端的第一个氨基酸（Ala）恰属于自我剪切效率最高的氨基酸种类， 因此很可能在SDSPAGE的样品处理时就出现了不同程度的剪切现象， 使重组子包含体在SDSPAGE后， Western blot显示出具有免疫原性的2条大小不同蛋白条带， 即除融合的Mr为110 000条带外还有1条剪切后的Mr为55 000条带。这种自我剪切的效率非常有利于获得单纯的目的蛋白， 但可惜的是不溶性包含体不利于后处理。鉴于在实际应用中希望能够获得可溶性的抗原， 我们对诱导表达条件进行了摸索。通过降低诱导温度和延长培养时间， 可以得到融合蛋白的部分可溶性表达， 但表达量明显减少。
　　
　　我们同时利用麦芽糖结合蛋白融合系统， 构建另一个表达载体pMALcJo1， 获得了高表达的可溶性融合蛋白， 并通过亲和层析纯化了该蛋白。尽管表达蛋白含有MBP， 但并未影响到Jo1的抗原特异性， 说明Jo1的N端对于Jo1的免疫原性贡献并不很重要。因此对于同一基因， 往往应该用不同表达载体进行表达， 有可能会筛选出最佳的表达系统， 获得更有应用价值的表达产物。

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