体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞CYP450 mRNA表达的影响

　　　　 作者：时红波， 陈煜*， 闫丽， 赵军， 段仲平， 武志明

【摘要】 　　目的: 通过比较未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞CYP4503A表达的影响， 为改善C3A细胞的功能活性以提高其治疗效果提供依据。方法: 分别用正常人血浆、 慢性重型肝炎患者血浆、 体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养C3A细胞， RTPCR法测定上述血浆培养的C3A细胞CYP4503A4 mRNA表达， 凝胶成像系统获取CYP4503A4/βaction相对值， 进行统计学分析。结果: 未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达均低于正常人血浆培养组(P&<0.05)， 而体外灌流处理的血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达高于未经灌流处理的血浆培养组(P&<0.05)。结论: 在进行生物人工肝治疗之前， 配合血液灌流技术对患者血浆进行适当的处理， 从而改善生物反应器中细胞的功能活性， 将可能提高生物人工肝的治疗效果。

【关键词】 C3A细胞; 慢性重型肝炎; CYP4503A; 血浆灌流

　　C3A细胞是目前惟一用于生物人工肝临床研究的肝肿瘤细胞株， 具有在肝衰竭患者血浆中生长良好等特点， 现已基本实现了细胞的大量培养、 保存和运输， 并已成功进行了Ⅰ、 Ⅱ期临床实验［1］。C3A细胞作为生物人工肝的核心组成部分， 其功能状态直接影响治疗效果。本实验通过比较未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆对C3A细胞中细胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）mRNA表达的影响， 为改善C3A细胞的功能活性以提高其治疗效果提供依据， 并为未来C3A细胞的改造与功能优化奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 C3A细胞株由首都医科大学附属北京佑安医院人工肝中心提供。正常人血浆采自12名25～50岁肝功能正常的健康人。12例慢性重型肝炎患者血浆来自本院人工肝中心2004-05/2004-12进行人工肝治疗患者的置出血浆， 患者均符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的慢性重型肝炎诊断标准［2］， 男女各6例， 年龄26～60岁。爱尔炭肾活性炭灌流器为河北廊坊市爱尔血液净化器材厂产品。DMEM培养基、 胰蛋白酶均为Gibco公司产品。TRIzol、 逆转录酶、 Taq酶、 RNasin、 OligodT、 βaction为华美公司产品。其余均为国产分析纯试剂。

　　1.2 方法

　　1.2.1 灌流血浆备用 取出灌流器内吸附材料于60℃烤箱中烤干， 称取干燥的吸附材料2 g， 放入50 mL离心管中; 在超净工作台中， 抽取生理盐水20 mL注入离心管中， 静置5 min， 抽出生理盐水， 重复上述操作1次; 向离心管中注入患者血浆12 mL， 静置30 min， 取出血浆备用。12例慢性重型肝炎患者血浆经上述方法处理后获得12例体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆。

　　1.2.2 细胞培养 将C3A细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板中， 细胞完全贴壁后， 将培养液分别置换为1 000 g/L正常人血浆、 1 000 g/L慢性重型肝炎患者血浆、 1 000 g/L体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆， 培养24 h后备用。

　　1.2.3 RTPCR （1）总RNA提取: 将长满细胞的培养瓶（25 cm2）取出， 用PBS冲洗1遍; 加入1 mL TRIzol， 平放培养瓶， 室温下静置至细胞全部消化; 移入无RNase污染的1.5 mL EP管中， 加入200 μL预冷的氯仿， 颠倒混匀， 室温静置2～3 min， 然后4℃， 12 000 r/min离心15 min; 转移上层水相于新的EP管中， 再加入500 μL异丙醇混匀， 室温静置10 min后4℃， 12 000 r/min离心10 min; 弃上清， 加入1 mL 750 mL/L乙醇洗涤， 4℃， 7 500 r/min离心5 min; 弃上清， 倒置在卫生纸上自然干燥， 最后加入20 μL无RNase水（DEPC水）溶解沉淀， -80℃保存备用。（2）逆转录反应: 5×RT Buffer 4.0 μL， dNTP（10 mmol/L）1.0 μL， OligodT（500 mg/L）1.0 μL， RNasin（40 U/μL）1.0 μL， MMLV（逆转录酶， 200 U/μL）1.0 μL， RNA提取物5.0 μL， 最后DEPC h3O 7.0 μL补足体积至20.0 μL， 40℃水浴30 min。（3）PCR扩增反应: CYP4503A4引物由上海生工生物工程公司合成， 扩增产物长度为398 bp。反应体系为: 10×PCR Buffer（含25 mmol/L Mg2+）3.0 μL， dNTP（10 mmol/L）1.0 μL， CYP4503A4引物（10 μmol/L）一对各1.0 μL， βactin（20 μmol/L）一对各1.0 μL， Taq酶（5 U/μL）1.0 μL， 逆转录反应产物取3.0 μL， 最后加入h3O 17.0 μL补足体积至30.0 μL。PCR反应条件: 95℃ 5 min预变性; 94℃ 30 s变性， 60℃ 40 s退火， 72℃ 30 s延伸， 反复进行40个循环; 72℃ 10 min延伸。（4）扩增产物检测: 将扩增产物在15 g/L EB琼脂糖凝胶中以100 v电泳30 min， 置于凝胶成像系统中进行图像扫描并计算CYP4503A4/βaction值。

　　1.2.4 统计学分析 数据以x±s表示， 利用SPSS11.0软件进行统计学分析， 组间比较采用t检验， P&<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 RTPCR检测 RTPCR检测结果见图1。

　　图1 不同血浆培养的C3A细胞CYP4503A4的RTPCR检测结果（略）

　　M: DNA marker; 1: 正常人血浆; 2: 未经灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆; 3: 体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆.

　　2.2 C3A细胞CYP4503A4 mRNA表达 未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达（分别为1.0916±0.0632和1.4671±0.1054）均低于正常人血浆培养组（1.8025±0.1147， P&<0.05）， 而体外灌流处理的血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达高于未经灌流处理的血浆培养组（P&<0.05）。

　　3 讨论
　　
　　CYP450是参与人体内药物和毒物代谢的重要酶类， 在肝细胞中CYP450以CYP1、 CYP2、 CYP3为主， 在这3种同工酶中， 又以CYP3A占的比例最大， 约占肝内CYP450总量的30％， 其中CYP3A4是CYP450亚族最主要的亚型［3］。研究表明某些细胞因子如IL1及胆汁酸、 胆红素、 氨等理化因素可通过抑制CYP450的基因转录而下调其功能［4， 5］。本实验结果显示， 未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达均低于正常人血浆培养组， 而体外灌流处理的血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达高于未经灌流处理的血浆培养组。慢性重型肝炎患者血浆中胆红素、 胆汁酸、 氨和某些细胞因子远远高于正常人血浆［6， 7］， 这些因素可能在某种程度上影响了C3A细胞CYP3A4的基因转录， 从而使其表达下降; 而体外灌流处理的血浆中胆红素、 胆汁酸、 氨和某些细胞因子水平有所降低， 从而使体外灌流处理的血浆培养的C3A细胞CYP3A4 mRNA表达有所增加。
　　
　　我们前期的研究工作提示［8］， 未经灌流处理和体外灌流处理的慢性重型肝炎患者血浆培养的C3A细胞CYP450活性及蛋白表达均低于正常人血浆培养组， 而体外灌流处理的血浆培养的C3A细胞CYP450活性及蛋白表达高于未经灌流处理的血浆培养组， 与本研究结果很好吻合， 并且本研究结果进一步证实了前期的研究结果， 不同血浆培养的C3A细胞CYP450活性及蛋白表达与其mRNA表达呈正相关。
　　
　　在我国， 急性肝衰竭患者相对较少， 进行生物人工肝治疗的大部分是慢性重型肝炎患者。在进行生物人工肝治疗之前， 配合血液灌流技术对患者血浆进行适当的处理， 从分子水平滤除胆红素、 胆汁酸和某些细胞因子以消除其对肝细胞代谢功能的负面影响， 使C3A细胞的CYP450表达维持在一定水平， 从而改善生物反应器中细胞的功能活性， 将可能提高慢性重型肝炎患者的治疗效果。在此基础上， 利用基因克隆等技术对C3A细胞进行改良和功能优化， 将可能改善生物人工肝核心细胞的功能活性， 使更多需要人工肝治疗的患者受益。

参考文献

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