自身免疫病患者血液中穿通支原体分离培养及其血清IL6与TNFα的检测

　　　　 作者：温秀姝， 王 澄， 周丽萍， 王赛芳， 刘欢乐

【摘要】 目的: 探讨自身免疫病AID患者血液中穿通支原体(Mpe)的分离检出以及Mpe感染患者血清中IL6与TNFα的浓度水平。方法: 采用分离培养共计从44例AID患者血液标本， 16例ASO或RF阳性体检人员及28例正常对照相应标本中进行支原体分离检测， 对培养阳性菌株采用穿通及发酵支原体套式PCR予以证实， 并用RIA对相应血清进行IL6及TNFα浓度检测。结果: 于17例（38.6%）AID患者血液中分离到Mpe， 2例（12.5%）ASO或RF阳性体检人员中分离到Mpe， 而正常对照组中则无1例阳性， 组间支原体检出率有统计学意义（P&<0.01）。支原体阳性AID组血液IL6浓度(3.30±1.49) μg/L与支原体阴性AID组(2.43±0.95) μg/L及正常对照组(1.14±0.32) μg/L之间差异有统计学意义(P&<0.01); 支原体阳性AID组血液TNFα浓度(293.3±179.9) ng/L与支原体阴性AID组(173.9±73.9) ng/L及正常对照组(108.8±33.8) ng/L组之间也有统计学意义(P&<0.01)。结论: Mpe感染与AID的发生密切相关， Mpe感染患者血清中IL6与TNFα较非感染对照人群明显升高。

【关键词】 穿通支原体; 自身免疫病; 血液; IL6; TNFα

　　穿通支原体（Mycoplasma penetrans， Mpe）是近年来新发现的致病性支原体［1， 2］， 有研究证实从艾滋病患者尿液标本中曾分离检出Mpe［1］， 并报道从抗磷脂综合症患者的血液和咽拭子以及呼吸道标本中均分离检出Mpe， 提示Mpe也可从非HIV感染人群中分离［2］。我们曾报道从IgA肾病患者的血液中分离检出Mpe， 与对照人群比较差异明显［3］， 提示Mpe可从自身免疫病(autoimmune disease， AID)患者体内检出。为了进一步探讨Mpe与AID相关机制， 我们同时检测AID患者血清中IL6与TNFα的水平。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 已知对照菌株Mpe（GTU ATCC55252）、 发酵支原体(Mf， ATCC19989）、 肺炎支原体（Mp， ATCC15531）解脲脲原体（Uu， ATCC27618）人型支原体(Mh， ATCC 23114)均由东南大学医学院流行病学教研室赵季文教授惠赠。Mpe和Mf nPCR试剂购自江苏无锡遗传研究所， IL6及TNFα试剂盒购自北京华英生物技术研究所。44例标本随机采自2007年7～8月间由我院自身免疫科确诊为类风湿关节炎（34例）、 干燥综合症（7例）、 免疫性白细胞减少（2例）及系统性红斑狼疮（1例）等原发性AID， 共计44例， 其中， 男12例， 女32例（平均年龄42.1）。对照I组16例为体检人员中抗链球菌溶血素O抗体（antistreptolysin“O”， ASO）或类风湿因子（rheumatoid factor， RF）有一项为超出正常范围者， 其中男7例， 女9例（平均年龄47.4）。对照II组为28例健康查体者， ASO与RF均为正常， 其中男14例， 女14例（平均年龄41.1）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 培养基准备 改良SP4液体培养基用于Mpe、 Mf和Mp的分离培养， Uu和Mh培养液以及生化试验培养基制备分别见文献［4］。

　　1.2.2 标本采集与接种 采集各实验组人员静脉血液4 mL（EDTAK2抗凝）， 取后置离心机内离心10 min（2 000 r/min）， 取血液标本的白细胞层接种于改良SP4以及Uu和Mh培养基; 血清留于细胞因子IL6、 TNFα的检测。接种标本后的支原体培养基于37℃ 50 mL/L CO2 4～5 d， 逐日观察并记录培养基颜色变化情况。若培养液颜色改变， 澄清， 则判为“可疑阳性”。过滤除菌、 并分别取0.1 mL转种支原体固体培养基和普通固体培养基（以排除L 型细菌）， 置50 mL/L CO2 ， 37℃ 24～72 h， 显微镜下观察， 发现油煎蛋样菌落， 并与同时接种的标准菌株相对照， 如在Uu或Mh培养液生长可初步判断为Uu或Mh。因在SP4培养液中4～5 d生长， 使液体产酸、 变黄的有Mpe、 Mf和MP， 借助生化试验和PCR予以鉴别。在此同时， 分别取IgA肾病患者血液标本进行常规血培养对照。

　　1.2.3 Mpe的分离培养与鉴定 阳性液体培养物接种固体培养基， 低倍镜下观察油煎蛋样菌落， 初步鉴定菌株经生化试验初筛后再采用Mpe、 Mf nPCR逐一筛查， 确认为检出特异MpeDNA。

　　1.2.4 细胞因子检测 所留取的各实验组的血清标本按说明书用RIA检测IL6与TNFα水平。

　　1.2.5 统计学分析 实验数据用x±s表示， 计量资料用SPSS11统计件软中χ2检验及t检验进行处理。

　　2 结果

　　2.1 AID患者血液中Mpe的检出 以上各血液标本均未见Uu或Mh生长， 血培养均阴性。取分离自血液使培养液由红变黄且澄清者， 排除L菌生长， 阳性液体培养物经生化试验初步鉴定为Mf和Mpe（既分解葡萄糖亦分解精氨酸而不分解尿素）， 并接种支原体固体培养基， 而后于高倍镜下可见油煎样菌落， 以上阳性培养液经nPCR核实（图1）为Mpe菌株。图1 培养阳性标本支原体nPCR产物电泳结果

　　2.2 AID患者血液中Mpe的检出例数 44例AID组中有17例培养检出Mpe， 检出率为38.6%; 16例对照I组中有2例（12.5%）培养检出Mpe; 28例对照II组（正常对照组）无1例支原体检出阳性， 此3组之间检出率有统计学意义（P&<0.01， 表1）。表1 AID患者与各对照组血液中Mpe的检出例数

　　2.3 AID患者血清中细胞因子检测结果 AID组感染Mpe的患者血中IL6（3.30±1.49） μg/L与TNFα水平（293.3±179.9） ng/L均高于同组未培养出Mpe的AID患者（P&<0.01）。未培养出Mpe的AID患者IL6（2.43±0.95） μg/L与TNFα水平（173.9±73.9） ng/L均高于对照II组（P&<0.01， 表2）。 表2 感染MpeA ID组及各对照组血清IL6及TNFα浓度水平

　　3 讨论

　　AID的确切病因和发病机制尚不十分清楚。除遗传因素外， 感染作为AID的触发因素倍受关注。有学者认为， 病原微生物的某些特殊蛋白抗原能与人体自身抗原发生交叉反应， 病原微生物感染机体后， 专职抗原提呈细胞能将与自身抗原发生交叉反应的某种微生物抗原提呈给自身反应性T细胞， 后者可被激活， 从而自身耐受遭破坏， 一些AID 发病与感染的关系已经明确［5］。Yáez等［2］于1999年首次报道从抗磷脂综合症患者的血液和呼吸道的分泌物中分离到Mpe（HF株）， 表明支原体的感染与AID有密切的关系。而支原体有逃避宿主的免疫监视的功能［6］， 从而有形成慢性感染的可能， 至使支原体触发自身免疫反应。

　　本实验结果显示， 确诊为AID患者组Mpe检出率（38.6%）明显高于对照I组（12.5%）与对照II组（P&<0.01）， 表明Mpe感染与类风湿关节炎等AID的发生有密切相关， 我们曾报道确诊为IgA肾病患者血液中Mpe分离率为36.9%［3］与本实验结果相符。结果表明， AID患者血清TNFα水平不但明显高于正常对照组(P&<0.01)， 更重要的是感染Mpe AID患者血清TNFα水平明显高于未培养出Mpe AID患者 (P&<0.01)。因此， Mpe感染者血液中TNFα、 IL6浓度明显高于非Mpe感染者及正常对照组， 提示Mpe感染与AID患者血清TNFα及IL6水平升高有关联。体外单核巨噬细胞组织培养证实Mpe感染后的1～2 h后即可刺激单核巨噬细胞过量分泌TNFα， TNFα的过量分泌必将促使IL6等前炎症因子的升高［7， 8］。这就导致了机体的细胞因子调节系统紊乱， 过量的TNFα不仅可以抑制IgG和IgM的产生， 而且影响某些克隆T细胞的分化， 使T淋巴细胞不能产生正常的免疫反应。

　　本实验中感染Mpe患者血清中IL6水平明显高于其他两组， 提示IL6在支原体感染的细胞免疫和体液免疫中具有重要作用。同时IL6可以激活NKκB而诱导ICAM1的极化表达， 这些介质使得内皮进一步损伤， 诱导中性粒细胞迁移、 黏附和浸润， 并可诱导其脱颗粒反应和溶酶体酶释放， 从而导致过度的炎症反应， 许多研究认为， IL6是RA炎症及关节损伤的重要介质之一， 活动性RA患者血清中IL6的水平升高［9］， 同样本实验也发现AID患者血清中IL6水平均明显高于正常对照组(P&<0.01)。虽然， TNFα和IL6均是具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子， 对免疫反应、 机体代谢、 炎症反应均有重要的调节和介导作用， 在正常情况下具有抗肿瘤、 抗感染等重要作用， 对机体有利， 但如果持续释放或产生过多或与其他细胞因子关系失调， 又会引起机体的发热、 休克， 恶病质或器官出血坏死等， 参与疾病的发病。显然， Mpe感染与AID之间的关系及其血清TNFα与IL6水平升高的确切机制还有待进一步探讨。

参考文献

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［3］ 温秀姝， 许菲菲， 王 静， 等. IgA肾病病人血液中穿通支原体的分离检出［J］. 中华微生物学与免疫学杂志， 2007， 27(5): 477-478.

［4］ 曹玉璞， 叶元康. 支原体与支原体病菌［M］. 北京: 人民卫生出版社， 2000: 293-295.

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