HBV X基因对成人肝细胞HL7702线粒体功能的影响

　　　　作者：林纳， 李 丹， 陈红英， 陈治新， 王小众

【摘要】 目的: 研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。 方法: 将HBV X基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞， 经过2周G418筛选， 获得稳定表达的新细胞株， 分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3， RTPCR和Western blot方法证实HBV X基因在HL7702/HBx细胞内的稳定表达。抽提细胞总RNA进行半定量RTPCR及分离细胞线粒体进行Western blot检测COX Ⅲ 表达水平变化， 并通过酶动力学方法检测线粒体细胞色素氧化酶活性。结果: 重组质粒pcDNA3X转染后经G418筛选， RTPCR和Western blot分析结果显示HL7702HBx细胞能够稳定表达HBV X基因。RTPCR和Western blot结果发现HBV X基因下调COX Ⅲ 蛋白表达而不影响mRNA水平表达。酶动力学检测发现线粒体细胞色素C氧化酶活性降低。结论: HBV X基因通过转录后水平调节COX Ⅲ表达， HBx通过与COXⅢ相互作用抑制线粒体细胞色素氧化酶活性。

【关键词】 HBx; COX Ⅲ; 线粒体细胞色素氧化酶

　　［Abstract］ AIM: To study the effect of HBx on a new HBxinteracted protein COXⅢ and mitochondria. METHODS: A recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3X was constructed， then pcDNA3X and pcDNA3 were steadily transfected in HL7702 separately， named HL7702/HBx and HL7702/pcDNA3. The expression of COXⅢ in HL7702/HBx， HL7702/pcDNA3 and HL7702 cells were detected by RTPCR and western blot. Mitochondrial cytochrome c oxidase activities of three groups were assayed spectrophotometrically at 550 nm by using partially purified mitochondria. RESULTS: COXⅢ mRNA expression didn’t change， while protein expression is downregulated in HL7702/HBx. Cytochrome c oxidase activity was much lower in HL7702/HBx compared with HL7702 and HL7702/pcDNA3 cells. CONCLUSION: HBx can downregulate COXⅢ expression through posttranscriptional level and inhibit mitochondrial cytochrome c oxidase activity.

　　［Keywords］HBx;　　COXⅢ;　　cytochrome c oxidase

　　［摘 要］ 目的: 研究HBV X基因与线粒体COXⅢ基因相互作用以及对线粒体功能的影响。 方法: 将HBV X基因真核表达载体pCDNA3X及空载体pCDNA3转染成人肝细胞HL7702细胞， 经过2周G418筛选， 获得稳定表达的新细胞株， 分别命名为HL7702/HBx和H7702/pcDNA3， RTPCR和Western blot方法证实HBV X基因在HL7702/HBx细胞内的稳定表达。抽提细胞总RNA进行半定量RTPCR及分离细胞线粒体进行Western blot检测COX Ⅲ 表达水平变化， 并通过酶动力学方法检测线粒体细胞色素氧化酶活性。结果: 重组质粒pcDNA3X转染后经G418筛选， RTPCR和Western blot分析结果显示HL7702HBx细胞能够稳定表达HBV X基因。RTPCR和Western blot结果发现HBV X基因下调COX Ⅲ 蛋白表达而不影响mRNA水平表达。酶动力学检测发现线粒体细胞色素C氧化酶活性降低。结论: HBV X基因通过转录后水平调节COX Ⅲ表达， HBx通过与COXⅢ相互作用抑制线粒体细胞色素氧化酶活性。

　　［关键词］HBx; COX Ⅲ; 线粒体细胞色素氧化酶

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）慢性感染是导致肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）的主要危险因子， HBV X基因全长转录体编码的X蛋白（HBx）含154个氨基酸， 相对分子质量(Mr)约为16 500。X基因及其产物HBx在肝炎病毒慢性感染过程中直接或间接促进HCC的发生、 发展。目前， HBx的亚细胞定位尚存在争议。Henkler等［1］发现X蛋白在低表达的细胞中完全或绝大部分定位于细胞核内， 而过量表达的X蛋白则分布于胞质中。另有学者观察到HBx在细胞质内的水平高于细胞核， 且细胞质中的HBx主要分布于线粒体外膜上［2］。

　　目前已证实HBx并不直接作用于双链DNA， 主要通过与细胞内多种蛋白质相互作用影响细胞的生物学功能， 故研究体内X结合蛋白对阐明X蛋白的作用及机制有重要作用。我们前期研究已经通过酵母双杂交体系从成人正常肝细胞cDNA文库中筛选出一种新的X结合蛋白细胞色素c氧化酶Ⅲ（cytochrome c oxidase Ⅲ， COXⅢ）［3］。细胞色素c氧化酶复合体是最具特征的呼吸链酶复合体， 由13个亚基组成， COXⅢ在复合酶的聚集和稳定性中起重要作用， 并参与质子的传递和细胞色素c氧化酶介导的能量转换［4］。

　　我们以成人肝细胞HL7702为研究对象的， 通过构建HBV X基因真核表达载体pcDNA3X， 并将其稳定转染给HL7702细胞， 检测HBx与COXⅢ的相互作用以及由此引起的线粒体结构和功能变化， 进一步阐明HBV的致癌机制。

1 材料和方法

　　1.1 材料 质粒抽提试剂盒购自深圳生物晶美公司、 pcDNA3表达载体购自Invitrogen公司; 重组HBV X基因真核表达载体pcDNA3X由本实验室保存。成人肝细胞株HL7702购自中科院上海细胞库， DMEM、 F12和胰蛋白酶购自Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司; 逆转录试剂盒， JetPEITMGal转染试剂盒购自法国Polyplus transfection公司， TRIzol试剂购自Invitrogen公司; 线粒体抽提试剂盒购自Piecer公司; 线粒体细胞色素氧化酶活性检测试剂盒购自美国Sigma公司。小鼠抗人乙肝病毒X蛋白购自Chemicon公司， 山羊抗人COXⅢ多克隆抗体、 小鼠抗人βactin单克隆抗体（mAb）购自美国Santa Cruz公司， 兔抗小鼠二抗、 马抗山羊二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司， Western blot实验的ECL显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 寡核苷酸引物设计 根据HBV X、 GAPDH、 COXⅢ基因序列自行设计引物， 由Invitrogen公司合成。HBV X基因上游引物5′ATGCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTACTG3′， 下游引物5′TGCGAATTCTTAGGCAGAGGTGAAAAAGTTG3′， 产物467 bp; GAPDH基因上游引物5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′， 下游引物5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′， 产物452 bp; COX III基因上游引物: 5′AGCCCATGACCCCTAACA3′， 下游引物5′CCTCATAGTTAGTGGACTCG3′， 产物463 bp。

　　1.2.2 重组pcDNA3X质粒稳定转染HL7702细胞 HL7702细胞生长于含100 mL/L 胎牛血清的DF （DMEM∶F12=3∶1）培养液中， 采用JetPEITMGal转染试剂盒将质粒pcDNA3和重组真核表达载体pcDNA3X转入HL7702肝细胞株中， 命名为HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx， 步骤如下: 选取对数生长期细胞， 消化接种于25 cm培养瓶， 细胞数为1×106/L， 待细胞贴壁后， 即可进行转染。取2支无菌试管， 分别加入5 μg DNA和16 μL JetPEI， 以250 μL NaCl（150 mmoL/L）稀释， 轻轻涡旋， 将JetPEI加入DNA中， 轻轻混匀， 室温孵育30 min。将细胞内培养液倒去， 加入新鲜培养液及500 μL DNA/JetPEI混合液， 轻轻摇匀， 继续培养48 h。转染结束后将细胞消化移入6孔板， 加入终浓度为800 μg/L G418进行筛选， 2周后分别获得单克隆细胞1株， 命名为HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx。

　　1.2.3 X基因在转染细胞中的表达 分别抽提HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx 3组细胞总RNA， 逆转录为cDNA。取cDNA 1 μL作为模板， 扩增HBV X基因片段。HBV X基因引物序列如上所述， PCR反应条件为94℃预变性5 min， 94℃变性45 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸1 min， 经25个循环。扩增产物在18 g/L琼脂糖凝胶中电泳， 观察结果。

　　取对数生长期HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx 3组细胞， 4℃预冷PBS洗涤细胞2次， 加入100 μL细胞裂解液（50 mmoL/L的TrisHCl， pH6.8， 100 mmoL/L二硫苏糖醇， 20 g/L十二烷基硫酸纳， 100 g/L甘油）， 所得溶液在沸水中煮10 min， 15 000 g离心10 min， 取上清即为细胞总蛋白溶液。测定蛋白浓度， 取50 μg总蛋白上样， 进行120 g/L SDSPAGE电泳， 经硝酸纤维素膜转移， 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液（TBS+1 mL/L Tween20）封闭后， 分别与小鼠抗人HBx mAb（1∶100）4℃孵育过夜， 洗涤后再与山羊抗小鼠二抗（1∶2 500）作用1 h， 经ECL底物化学发光显影， 测量胶片中条带灰度值。

　　1.2.4 COXⅢ基因在转染细胞中的表达变化 分别抽提HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx 3组细胞总RNA， 逆转录为cDNA。取cDNA 1 μL作为模板， 以GAPDH为内参扩增COXⅢ 基因片段。引物序列如上所述， PCR反应条件为94℃预变性5 min， 94℃变性45 s， 58℃退火30 s， 72℃延伸1 min， 经25个循环。扩增产物在18 g/L琼脂糖凝胶中电泳， 观察结果。

　　分别取对数生长期HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx细胞， 梯度离心法分离线粒体和胞质蛋白。以2×蛋白上样缓冲液稀释线粒体和胞质蛋白， 煮沸变性后进行100 g/L SDSPAGE电泳， 经硝酸纤维素膜转移， 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液（TBS+1 mL/L Tween20）封闭后， 分别与山羊抗人COXⅢ 多克隆抗体（1∶100）及小鼠抗人βactin mAb（1∶300）4℃孵育24 h， 洗涤后再分别与马抗山羊二抗（1∶2 000）和山羊抗小鼠二抗（1∶2 500）作用1 h， 经ECL底物化学发光显影， 测量胶片中条带灰度值。

　　1.2.5 细胞色素C氧化酶（COX）活性在转染细胞中的变化 真核细胞的细胞色素C氧化酶通过与电子耦合为细胞提供能量。细胞色素C氧化酶的底物为细胞色素C， 在酶促反应过程中， 随着底物被氧化， 反应溶液550 nm吸光度呈逐渐下降趋势， 通过检测A550下降速率可反映细胞色素C氧化酶活性。取对数生长期HL7702、 HL7702/pcDNA3、 HL7702/HBx细胞， 消化离心收集细胞约1×107/L， 分离线粒体。将线粒体重悬于1.05 mL氧化酶稀释液中， 加入50 μL 反应底物细胞色素C， 颠倒混匀， 紫外分光光度仪， 550 nm检测反应溶液A550值， 间隔2 s检测1次， 共2 min， 根据A550值变化计算细胞色素C氧化酶活性。

2 结果

　　2.1 稳定表达HBV X基因HL7702细胞的鉴定 将pcDNA3和pcDNA3X质粒分别转染HL7702细胞， 经过2周G418筛选， 取阳性克隆扩大培养， 命名为HL7702/pcDNA3和HL7702/HBx。RTPCR （图1）和Western blot （图2）结果显示， 仅稳定转染pcDNA3X质粒的HL7702细胞有HBV X基因mRNA和蛋白表达， 而转染pcDNA3质粒的细胞则不表达。成功构建了稳定表达HBV X基因的成人肝细胞HL7702细胞株。

　　2.2 HBV X基因对HL7702细胞COXⅢ 表达的影响 COX Ⅲ 与GAPDH RTPCR结果如图2所示， 凝胶成像系统扫描灰度值: HL7702组灰度值1.05±0.18; HL7702/pcDNA3组灰度值0.93±0.20; HL7702/HBx组灰度值1.21±0.50。 SPSS12.0统计软件单因素方差分析表明COX Ⅲ 表达的mRNA水平在3组细胞间无统计学意义。 COXⅢ与βactin蛋白电泳结果如图3所示， BandScan软件扫描灰度值: HL7702组 69.65±0.148; HL7702/pcDNA3 组 22.24±0.058; HL7702/HBx组 10.64±3.17。SPSS12.0统计软件单因素方差分析发现在HBx稳定表达的细胞中， COXⅢ 蛋白表达显著下调， 差别有统计学意义（P&<0.05）。

　　2.3 线粒体细胞色素C氧化酶活性测定 实验结果表明稳定转染HBx的HL7702细胞COX活性明显降低如图所示（图5）。根据公式Unit/mL=△A/min×dil×1.1/线粒体体积×21.84计算COX活性， HL7702组COX活性41.37±3.95 (unit/mL); HL7702/pcDNA3组COX活性32.53±4.80 (unit/mL); HL7702/HBx组COX活性 16.02±7.74 (unit/mL) 。SPSS12.0统计软件单因素方差分析显示HL7702/HBx组COX活性降低（P&<0.05）。图5 3组细胞COX活性测定结果

　　Fig 5 Cytochrome oxidase activity

3 讨论

　　HBV慢性感染是导致HCC的主要危险因子， 在HCC发生、 发展过程中起重要作用， 但其具体致癌机制还不十分明确。近几年， 对HBV X基因的研究主要基于两方面， 即转HBV X基因的肝细胞模型及小鼠动物模型的研究， 肝细胞模型多以肝癌细胞株（如HepG2、 QGY7701、 HCC9204等）和肝癌组织为对象。我们以正常成人肝细胞株HL7702为研究对象， 将HBV X基因导入细胞内， 能更准确地模拟HBV慢性感染的生理状态。通过观察、 检测HBV X基因导入后细胞形态和功能变化， 可以更直观反映HBV X基因的生物学功能。本实验成功构建稳定表达HBV X 基因成人肝细胞株， 为后续研究搭建了一个良好的实验平台。

　　线粒体是特殊的细胞器， 氧化磷酸化等重要的细胞能量代谢都在线粒体内进行， 是细胞能量产生的主要场所。最新的研究发现， HBx可以定位在线粒体上， 结合的区域已经被定位在68～77氨基酸， 这一区域是细胞凋亡必须的， 但是对反式激活作用并不是必须的［1， 5］， HBx与线粒体的关系正逐渐成为目前研究的热点。Shirakata 等研究发现HBx和线粒体结合后， 并不直接引起细胞色素C和凋亡诱导因子（AIF）重分布， 但线粒体跨膜电压却降低了， 提示HBx可能干扰了MTP的功能。BclXL能通过稳定线粒体膜抑制HBx的作用， 进一步证实了HBx能作用在线粒体通透性转换孔（MTP）， 降低线粒体跨膜电压。HBx还可以和线粒体外膜蛋白VDAC3（voltagedepended anion channel 3）直接结合， 干扰MTP功能， 引起线粒体跨膜电压的下降， 激活包括STAT3和NFKB在内的转录因子［6］。

　　细胞色素c氧化酶复合体（复合体Ⅳ）是最具特征的呼吸链酶复合物， 由13个亚基组成， 其中较大的亚基COXⅠ， COXⅡ和COXⅢ由mtDNA编码。我们前期研究发现的HBx结合蛋白COXⅢ是线粒体呼吸链酶复合物Ⅳ的重要组成部分， 对维持复合酶的聚集和稳定性中起重要作用， 并参与质子的传递和细胞色素c氧化酶介导的能量转换。

　　本实验结果提示， HBV X基因下调COXⅢ蛋白表达， 而对mRNA表达没有影响， 说明HBV X基因主要影响COXⅢ的转录后表达水平。细胞色素C氧化酶活性检测结果显示， HBV X基因可抑制COX酶活性， 可能的机制除了HBV X基因抑制COX Ⅲ蛋白表达外， HBx还可能通过与COX III结合改变其三维空间构象， 阻碍复合物Ⅳ 其他亚基与COXⅢ结合， 最终影响复合物Ⅳ装配， 导致复合物Ⅳ稳定性下降［7］。近期研究发现， 虽然复合物Ⅳ不直接参与电子链传递， 但是它有助于维持复合物Ⅰ的稳定性［8］。另外一些研究发现， 复合物Ⅳ也影响复合物Ⅱ和复合物Ⅲ的活性， 抑制复合物Ⅳ活性可影响复合物Ⅰ和复合物ⅡⅢ的活性， 进而影响呼吸链功能， 导致跨膜电位下降［9］。

　　除了为细胞提供能量以外， 线粒体也是很多重要中间代谢途径的场所， 比如糖， 氨基酸， 脂肪代谢等。最近的研究发现， 当线粒体呼吸链功能受损， 氧化磷酸化障碍时， 糖代谢作为一种代偿机制为机体提供能量， 但是效率明显低于氧化磷酸化过程。许多肿瘤细胞主要通过糖代谢而不是氧化磷酸化过程提供ATP［10］。本实验结果为研究HBV X基因在HCC发生、 发展过程中的作用机制提供了良好的基础。

参考文献

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