环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体小鼠模型的建立

　　　　 作者：郭紫芬 何淑雅， 朱炳阳， 廖端芳

【摘要】 目的: 观察不同剂量环磷酰胺(CP)诱导免疫耐受的作用， 建立一个免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体（mAb）的动物免疫模型。方法: 雌性 BALB/c小鼠经CHO细胞免疫后分别给予不同剂量的CP诱导免疫耐受， 选择血清抗体效价最低的一组小鼠按常规方式腹腔注射CHOTM5细胞进行免疫。ELISA测定各小鼠血清中CHO抗体及CHOTM5抗体效价， 检测血清抗体对CHO细胞与CHOTM5细胞结合反应的差异性。结果: BALB/c小鼠腹腔注射不同剂量的CP后， 各剂量组均出现不同程度的免疫耐受作用。CP 100 mg/kg组与CP 125 mg/kg组小鼠血清抗体效价较低， 接近阴性对照组。ELISA检测显示CP 100 mg/kg组血清抗体与CHOTM5细胞呈阳性结合反应， 不与CHO细胞结合; 而CP 0 mg/kg组血清抗体与CHO细胞与CHOTM5细胞的结合反应均呈阳性。结论: CP 100 mg/kg具有良好诱导小鼠对CHO和CHOTM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受， 相对增强对CHOTM5细胞目的抗原hTM的免疫应答的作用， 为免疫删减法制备细胞表面抗原mAb提供了一个理想的动物免疫模型。

【关键词】 免疫耐受; 环磷酰胺; 细胞表面抗原; ELISA

　　环磷酰胺(cyclophosphamide， CP)是一种非特异性免疫抑制剂， 可抑制各种动物的体液与细胞免疫应答［1， 2］， 与抗原联用时能选择性杀伤针对外来抗原迅速增殖B细胞， 并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受， 而不影响机体免疫系统对其他抗原的识别。国内外学者已将环磷酰胺免疫删减法成功用于单克隆抗体(monoclonal antibody， mAb)的制备［3-5］ 。但CP免疫删减作用效果难以控制， 给药剂量和给药时间是十分关键的因素。因其不能完全抑制抗非目的抗原抗体的产生， 而药物本身的毒性作用往往可引起小鼠免疫系统的全面抑制， 使小鼠因感染等原因而死亡， 导致免疫的失败。本研究拟针对细胞表面目的抗原提纯方法繁琐或提纯困难的特点， 进行了CP免疫删减法的动物模型研究， 为制备细胞表面抗原mAb的动物免疫模型选择提供参考依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 环磷酰胺为上海第三制药厂产品; 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为法国Immunotech公司产品; BALB/c小鼠购自中国科学院上海动物实验中心。CHO细胞株由南华大学药物药理研究所提供; 携带目的抗原 hTM的CHOTM5细胞株本人构建并保存于南华大学药物药理研究所。M750B紫外分光光度仪为江苏泰州无线电仪器厂产品; CO2培养箱为日本Sanyo公司产品; COCI型倒置显微镜为重庆光学仪器厂产品; DG5301型酶联免疫检测仪为国营华东电子管厂产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物分组 将8～10周龄BALB/c雌性小鼠分为8组， 每组3只: ①CP 0 mg/kg组; ②CP 25 mg/kg组; ③CP 50 mg/kg组; ④CP 75 mg/kg组; ⑤CP 100 mg/kg组; ⑥CP 125 mg/kg组; ⑦CP 150 mg/kg组; ⑧阴性对照组， 不用任何抗原刺激， 亦不应用CP。

　　1.2.2 动物免疫 取生长良好的CHO细胞以无菌PBS洗涤3遍， 终以无菌PBS悬浮， 调整细胞密度至2×1010/L， 对8周龄的雌性BALB/c小鼠行腹腔注射(1×107/只)， 而后分别于10 min、 24 h、 48 h给小鼠腹腔注射不同剂量的免疫删减剂药物CP。2周后重复此过程， 诱导小鼠对CHO和CHOTM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受。第2次CHO细胞免疫后10 d， 眼眶取血测定各小鼠血清中抗体效价， 选取抗体效价最低的一组小鼠与CP 0 mg/kg组， 经过2周后再按常规方式腹腔注射生长状态良好的携带目的抗原hTM的CHOTM5细胞免疫小鼠(5×106/只)， 共免疫3次， 免疫间隔时间为2周。

　　1.2.3 ELISA检测小鼠血清抗体效价及与细胞的反应性 第2次CHO细胞免疫后10 d， 眼眶取血ELISA测定各小鼠血清中CHO抗体效价， 检测抗体对CHO细胞的结合反应性。在包被有CHO细胞的聚氯乙烯ELSIA板中加入不同滴度的血清， 37℃温育2 h后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG继续37℃温育2 h， 邻苯二胺显色液显色后在酶标仪上测定490 nm波长时的A值。设阴性对照组小鼠血清为阴性对照， 2 g/L BSAPBS为空白对照。根据测定结果选取抗体效价最低的一组小鼠与CP 0 mg/kg组， 按常规方式用携带目的抗原hTM的CHOTM5细胞免疫。第3次CHOTM5细胞免疫后3 d， 尾静脉取血， 方法同前进行ELISA法测定小鼠血清中CHOTM5抗体效价， 同时检测抗体对CHOTM5及CHO细胞的结合反应的差异性。

　　1.2.4 统计学分析 所有数据均用x±s表示， 用方差分析及两两t检验进行统计分析， 以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同剂量环磷酰胺诱导小鼠对CHO细胞免疫耐受的影响 CP 0 mg/kg组由于没有免疫删减剂CP的抑制作用， 血清中抗CHO细胞抗体效价最高， 抗体滴度＞1∶10 000， 是我们此次实验研究用来评价CP免疫删减法增强小鼠对CHOTM5细胞株的细胞表面目的抗原hTM的免疫应答效果的CP对照组。除CP 150 mg/kg组3只小鼠全部死亡外， 其余CP各剂量组小鼠血清与CHO细胞均有不同程度的结合反应， 与CP 0 mg/kg组比较(P&<0.05)， 有统计学意义， 不同剂量的CP对小鼠有不同程度的免疫删减作用。CP 100 mg/kg组与CP 125 mg/kg组小鼠血清抗体效价较低， 均接近阴性对照组， 并且经过两两比较， 无统计学意义(图1)。因此， 为了避免CP剂量过大带来的毒副作用， 选择较小剂量组CP 100 mg/kg组的小鼠准备后续CHOTM5细胞免疫。

　　2.2 环磷酰胺增强小鼠对CHOTM5细胞目的抗原hTM的免疫应答 CP 100 mg/kg组血清中抗CHOTM5细胞抗体效价为1∶2 000， 与CHOTM5细胞有较好的结合反应性， 与0 mg/kg组及阴性对照组比较， 有统计学意义(P&<0.05， 图2)。ELISA检测血清抗体（血清滴度为1∶2 000）与CHO及CHOTM5细胞结合反应差异性的结果显示: 0 mg/kg组血清与CHO细胞及CHOTM5细胞均能发生较好的结合反应， 而CP 100 mg/kg组血清只与CHOTM5细胞有较好的结合反应性， 而与CHO细胞不结合（图3）。

　　3 讨论

　　环磷酰胺免疫删减法的基本原理［6］是当某种抗原诱发一种特异的免疫应答时， 相应的B细胞与T细胞克隆均发生增殖， 处于分裂期的细胞易被烷化剂CP选择性杀死， 因而当相同成分的抗原再次进入机体时， 机体对其免疫应答即被抑制， 并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受， 而不影响机体免疫系统对其他抗原的识别。因此环磷酰胺免疫删减法为mAb的制备提供一种新的途径和可能， 即可用未经纯化的抗原进行免疫， 有利于获得预期的抗体， 减少了筛选的工作量等。

　　但值得注意的是， CP的作用效果难以控制。CP的应用剂量、 程序对目的抗原分子的mAb的制备起着相当重要的作用。因此CP免疫删减法用于mAb制备成功的关键是制造一个能良好区别两种相近组成成分的动物免疫模型。本实验中设计了不同的CP剂量组诱导小鼠对CHO细胞产生免疫耐受。CP 150 mg/kg组由于剂量过大， CP的毒副作用造成3只小鼠衰竭死亡; CP 25 mg/kg组、 CP 50 mg/kg组以及CP 75 mg/kg组由于剂量过小， 不完全诱导小鼠特异性的免疫耐受; CP 100 mg/kg组与CP 125 mg/kg组能较好降低机体免疫系统对CHO细胞的反应性， 有效完全诱导小鼠免疫耐受。为了避免CP剂量过大带来的毒副作用， 我们选择较小剂量组(CP 100 mg/kg组)进一步观察CP增强小鼠对目的抗原hTM免疫应答的作用。

　　ELISA检测比较抗体与抗原的结合能力的差异时， 要求包被的抗原量相等。本实验中ELISA检测小鼠血清CHOTM5抗体效价时尽管包被ELISA板的细胞数目一致， 但抗原蛋白量有很大的差异。由于包被的目的抗原hTM含量远远低于CHO细胞总蛋白量， CP 100 mg/kg组对CHOTM5细胞的结合反应能力要弱于0 mg/kg组(P&<0.05)， 但CP 100 mg/kg组血清不与CHO细胞结合的事实说明CP 100 mg/kg组血清抗体是特异性抗hTM的抗体。

　　总之， 我们成功地建立了一个免疫删减法制备细胞表面抗原mAb的动物免疫模型， CP 100 mg/kg组能很好地诱导小鼠对CHO和CHOTM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受， 相对增强对CHOTM5细胞目的抗原hTM的免疫应答的作用， 为mAb的进一步研制打下了良好的基础。

参考文献

［1］ 姜玉章， 季晓辉， 李玉峰， 等. 环磷酰胺和环孢素A对SLE患者外周血Th细胞亚群免疫调节的作用［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2008， 24(2): 172-174.

［2］ Su YC， Rolph MS， Cooley MA， et al. Cyclophosphamide augments inflammation by reducing immunosuppression in a mouse model of allergic airway disease［J］. J Allergy Clin Immunol， 2006， 117(3): 635-641.

［3］ Sleister HM， Rao AG. Subtractive immunization: A tool for the generation of discriminatory antibodies to proteins of similar sequence［J］. J Immunol. Methods， 2002， 261(1-2): 213-220.

［4］ Sakakibara K， Sato K， Iwasaki T， et al. Generation of an antibody specific to Xenopus fertilized eggs by subtractive immunization［J］. Genes to Cells， 2005， 10(4): 345-356.

［5］ Zijlstra A， Testa1 J E， Quigley J P. Targeting the proteome/epitome， implementation of subtractive immunization［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2003， 303(3): 733-744.

［6］ Williams CV， Stechmann CL， McLoon SC. Subtractive immunization techniques for the production of monoclonal antibodies to rare antigens［J］. Biotechniques， 1992， 12(6): 842-847.