STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

　　　　 作者：吴维光， 于月成， 陈亚琼， 曹秀琴

【摘要】 目的: 探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA（shRNA）真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用。方法: 根据siRNA设计原则， 结合pSilencer2.1U6neo质粒特点， 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段， 退火后克隆入pSilencer2.1U6neo质粒， 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞。RTPCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平; MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡。结果: 成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体， 转染人宫颈癌SiHa细胞。细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降; 同时SiHa细胞增殖能力下降， 细胞凋亡增加。结论: 构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达， 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力， 诱导细胞凋亡。

【关键词】 SiHa细胞; STAT3; RNA干扰; 增殖; 凋亡

　　信号转导子及转录活化子（signal transducers and activators of transcription， STATs）是细胞因子和生长因子受体信号的下游效应物， 在细胞核内与特异性的DNA启动子结合， 调节相关基因的表达［1］。在哺乳动物7个STAT家族成员中， STAT3是近年来研究异常活跃的转录因子。STAT3已被确认为是癌基因［2］， 在包括宫颈癌在内的多种恶性肿瘤组织中高表达［3］， 与肿瘤增殖分化、 细胞凋亡、 新血管生成和免疫逃逸密切相关［4］。阻断STAT3信号转导通路可抑制胰腺癌细胞增殖功能［5］。本研究中利用RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术， 以pSlinlencer2.1U6neo载体中的U6为启动子， STAT3为靶基因， 构建STAT3siRNA表达载体， 转染人宫颈鳞癌SiHa细胞， 抑制STAT3基因表达， 观察SiHa细胞增殖和凋亡的变化。

1 材料和方法

　　1.1 材料 人宫颈癌细胞株SiHa细胞购自武汉典型生物保藏中心， 胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司， RPMI1640培养液（Gibco）、 质粒pSilencer2.1U6neo（Ambion）、 DH5α为清华天为时代公司产品， 质粒小提取试剂盒购自北京博克泰克公司， 凝胶回收试剂盒和质粒大提取试剂盒购自Qiagen公司， Lipofectimane 2000脂质体转染试剂盒、 FITCannexin V凋亡试剂盒和cDNA逆转录试剂盒购自Invitrogen公司， 各种工具酶购自TaKaRa公司， STAT3单克隆抗体（mAb）购自Santa cruz公司， MTT试剂购自Sigma公司， PCR引物和短发夹RNA（Short hairpin RNA， shRNA）表达载体插入片段的寡核苷酸链由北京奥科生物公司合成， STAT3 shRNA表达载体测序由大连亚法生物技术公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 STAT3特异性shRNA转录模板的设计及合成 根据GenBank中STAT3人全长cDNA序列（No.003150）， 参考相关文献选取特异性的序列为干扰作用的靶点［6］， 加入9 bp的环结构， U6启动子终止序列， 并引入两个酶切位点， 以确保退火后可以插入质粒pSilencer2.1U6neo中且读框正确。采用国际通用的与所有基因均无同源性序列的nontarget siRNA作为阴性对照。人工合成一对互补并编码短发状siRNA的寡核苷酸链序列如下: STAT3 正义 5′GATCCATCCAGAGTCACTGGAAGTTTCAAGAGAAGTTCCAGTGACTCTGGATTTTTT

　　TGTCGACA3′， 反义5′AGCTTGTCGACAAAAAAATCCAGAG

　　TCACTGGAACTTCTCTTGAAAGTTCCAGTGACTCTGGATG3′。 阴性对照正义 5′GATCCTTCTCCGAACGTCTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGTCGACA3′， 反义5′AGCTTGTCGACAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCT

　　TGAAACGTGACACGTTCGGAGAAG3′。

　　1.2.2 重组质粒的构建和瞬时转染 将上述的DNA片段退火， 用T4连接酶连接于经双酶切（Hind III， BamH I）的质粒pSilencer2.1U6neo中， 连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α， 涂于氨苄抗性（终浓度为50 mg/L）的LB培养基上， 次日随机挑取菌落， 接种于LB培养液中， 振荡过夜， 碱裂解法快速抽提质粒， 紫外分光光度法定量。SiHa细胞在含100 mg/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液中， 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养。取对数生长期细胞接种于6孔板， 密度达80%时， 用Lipofectamine 2000转染重组质粒， 转染6 h后更换含200 mg/L FBS培养液继续培养48 h。用500 mg/L的G418筛选3周， 存活的细胞为已转染质粒的细胞。细胞分4组: 正常对照组（无干预措施， 简称SiHa）; 空载体对照组（转染空质粒， 简称SiHaVEC）; 非特异siRNA对照组（转染pSilencer2.1U6neononspecific 质粒， 简称SiHaNS）; 目的siRNA实验组（转染pSilencer2.1U6neoSTAT3质粒， 简称SiHasiRNA）。

　　1.2.3 RTPCR检测STAT3 mRNA表达 TRIzol一步法提取细胞总RNA， 以(oligo) dT为引物逆转录合成cDNA第一链。以2 μL的cDNA为模板进行PCR扩增， GAPDH为内参照。STAT3引物序列为: 上游 5′CCCATACCTGAAGACAAGTTTATC3′， 下游5′TGGAAATAATGGTGAAGGTGCTG3′， 扩增片段为125 bp。GAPDH引物序列为: 上游5′CATCTTCTTTTGCGTCGCCA3′， 下游5′TCGCCC CACTTGATTTTGG3′， 扩增片段为315 bp。PCR反应条件为: 95℃预变性3 min， 然后95℃ 30 s、 52℃ 45 s、 72℃ 45 s， 35个循环后再72℃延伸7 min。扩增产物20 g/L琼脂糖凝胶电泳， LabWork 3.0 UVP软件（UVP USA）扫描电泳条带， 以特异扩增条带与内参条带光密度之比作半定量分析。

　　1.2.4 Western blot检测STAT3蛋白表达 收集细胞， 裂解缓冲液提取细胞总蛋白， 经Bradford法定量后进行SDSPAGE电泳， 蛋白量为20 μg， 将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上， 50 g/L脱脂奶粉封闭， 加1∶400鼠抗人STAT3 mAb， 4℃过夜， TBST洗3次， 每次15 min。加1∶1 000辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG， 室温反应， TBST洗3次， 每次15 min， ECL发光压片显色， 以βactin为内参照， 用LabWork 3.0 UVP软件分析条带的积分光密度值， STAT3蛋白相对量= STAT3蛋白条带光密度/βactin条带光密度。

　　1.2.5 MTT法检测细胞增殖能力 取各组细胞， 调整细胞密度为5×108/L， 接种于96孔培养板中， 每组细胞设3个平行孔。细胞贴壁后， 加入无血清培养液12 h， 使细胞同步化。更换含100 mg/L胎牛血清（FBS）的培养液， 37℃、 50 mL/L CO2条件下培养72 h。每孔加入浓度为5 g/L的四甲基偶氮唑蓝（MTT）液20 μL， 继续培养4 h， 弃培养液， 加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO）， 酶标仪测定各孔490 nm处的吸光度（A值）。细胞增殖率=（实验组平均A值）/（对照组平均A值）×100%。实验重复3次。

　　1.2.6 FCM检测细胞凋亡率 FCM检测细胞凋亡操作按凋亡试剂盒说明书进行。收集各组细胞， PBS洗涤1次， 在0.5 mL结合缓冲液中加入6 μL FITCannexin V和20 μL的PI， 室温下避光孵育15 min， 离心弃上清， 加入300 μL 结合缓冲液， FCM检测凋亡率， 计数1×104个细胞。实验重复3次。

　　1.2.7 统计学分析 数据以x±s表示， 数据采用SPSS11.5统计软件分析， 多组间差异比较采用单因素方差分析， 两组间比较采用LSD法， P＜0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 人STAT3基因siRNA重组质粒酶切鉴定及测序 将重组质粒经Hind III和BamH I双酶切后， 行琼脂糖凝胶电泳， 有与插入片段大小相符的条带， 未酶切的相应重组质粒未见插入片段条带。STAT3基因siRNA双链成功地插入到pSilencer2.1U6neo质粒中， 重组质粒命名为pSilencer2.1U6neoSTAT3。以pSilencer2.1U6neo特有的测序引物对pSilencer2.1U6neoSTAT3进行测序， 测序结果与合成的STAT3 siRNA寡核苷酸序列完全一致。

　　2.2 RTPCR检测细胞STAT3 mRNA结果 细胞STAT3 mRNA检测表达结果见表1和图1。SiHa、 SiHaVEC、 SiHaNS组的STAT3 mRNA水平三组间比较， 差异无统计学意义（P&>0.05）， 而SiHasiRNA组STAT3 mRNA水平与三对照组比较明显降低， 差异均有统计学意义（P＜0.01）。表1 细胞STAT3表达、 增殖率及凋亡率检测结果

　　2.3 Weatern blot检测STAT3蛋白结果 细胞STAT3蛋白检测结果见表1和图2。SiHa、 SiHaVEC、 SiHaNS组的STAT3蛋白表达三组间比较， 差异无统计学意义， 而SiHasiRNA组STAT3表达水平与三对照组比较明显降低， 差异均有统计学意义（P＜0.05）。图1 细胞STAT3 mRNA PCR检测图

　　2.4 MTT检测细胞增殖率结果 各组细胞增殖率检测结果见表1。SiHa、 SiHaVEC、 SiHaNS组的增殖率三组间比较， 差异无统计学意义， 而SiHasiRNA组增殖率与三对照组比较明显降低， 差异均有统计学意义（P＜0.05）。

　　2.5 FCM检测细胞凋亡结果 各组细胞凋亡率检测结果见表1。SiHa组、 SiHaVEC、 SiHaNS组凋亡率三组间比较， 差异无统计学意义， 而SiHasiRNA组凋亡率与三对照组比较明显增加， 差异均有统计学意义（P＜0.01）。

　　3 讨论

　　RNAi现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（doublestranded RNA， dsRNA）引发的体内序列特异性基因转录后的基因沉默过程［7］。其作用机制是dsRNA被核酸内切酶III样蛋白加工成21～25个核苷酸组成的siRNA， siRNA与解旋酶、 核酸酶及一些相关因子结合成RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex， RISC）。RISC在siRNA引导下， 特异地切割与siRNA同源的靶mRNA， 使其降解， 细胞表现出特定基因缺失的表型［8］。由于RNAi对染色体DNA序列的复制和转录过程不产生影响， 具有高度的序列特异性和抑制基因表达的高效性。所以， 迅速成为一种功能强大的、 选择性抑制特异基因表达的工具， 也为肿瘤的基因治疗提供了新方法［9］。目前有体外化学合成、 体外转录（应用T7启动子）和应用DNA载体体内转录3种方式生成siRNA， 其中DNA载体体内转录方法是利用U6启动子， 构建siRNA表达载体， 在真核细胞内稳定表达siRNA， 能长期沉默真核细胞内特定基因。本研究构建针对STAT3基因的shRNA表达载体， 脂质体介导转染SiHa细胞。Western blot和RTPCR检测结果显示， STAT3蛋白及mRNA表达均明显下降。说明STAT3基因的shRNA表达载体成功地抑制了SiHa细胞STAT3基因的表达。

　　STAT3通过调控与细胞增殖、 分化、 生存、 凋亡密切相关的关键基因的表达， 促进细胞增殖、 恶性转化、 血管生成、 阻碍细胞凋亡， 表现出较强的致癌作用。研究发现， STAT3在宫颈癌等多种肿瘤组织中表达增加或活性增强［10］。因此， STAT3可能成为宫颈癌基因治疗的靶基因。本研究显示， STAT3基因的shRNA表达载体在抑制SiHa细胞STAT3基因表达的同时， 细胞的增殖能力下降， 凋亡率增加。结果说明STAT3基因的shRNA表达载体能通过抑制STAT3基因表达而抑制宫颈癌细胞的生长， 诱导细胞凋亡。本研究结果为以STAT3为靶基因、 以RNAi为方法的宫颈癌基因治疗奠定实验基础。

参考文献

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