EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

　　　　 作者：毛丽萍 王惠民， 王跃国， 汪晓莺

【摘要】 目的: 构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3， 使EBF3EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。方法: 采用RTPCR技术， 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因， 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3， 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2， 使EBF3EGFP融合蛋白得到表达。结果: 经转化细菌、 抽提质粒、 酶切鉴定和DNA序列分析证实， EBF3基因已正确插入pEGFPN1中EGFP基因的上游， 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后， 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3EGFP融合蛋白主要表达于核内， 转染pEGFP/EBF3和pEGFPN1后48 h的转染效率分别为52%和59%。Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量（Mr）为87 000的EBF3EGFP融合蛋白， 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h， S期细胞比例均明显高于pEGFPN1转染细胞组和未转染细胞组， 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展， 从而促进细胞增殖。结论: 成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3， 并在HepG2细胞中进行了表达， 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。

【关键词】 早期B细胞因子3; 融合蛋白; 增强型绿色荧光蛋白; HepG2细胞

　　［Abstract］ AIM: To construct the eukaryotic expression vector for early human Bcell factor 3(EBF3) fused with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and express the fusion protein EBF3EGFP in HepG2 cells. METHODS: The intact EBF3 gene was amplified from RNA isolated from the placental tissue by RTPCR. Then it was inserted into the pEGFPN1 vector to construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP/EBF3. The fusion protein EBF3EGFP was expressed in HepG2 cells by the transfection of pEGFP/EBF3 into the cells. RESULTS: The pEGFP/EBF3 recombinant expression vector was constructed and confirmed by DNA sequencing， enzymatic digestion and PCR identification. 24 h after the fusion protein EBF3EGFP was transfected wiht pEGFP/EBF3， it was observed mainly in the cellular nucleus under the inverted fluorescence microscope. Both pEGFP/EBF3 and pEGFPN1 were transfected into human HepG2 cells. 24 h after the transfection， the proportion of transfection was about 52% and 59%， respectively. Western blot analysis confirmed that the EBF3EGFP fusion proteins of Mr 87 000 were detected in the cytoplasmic and nuclear protein of HepG2 transfected with pEGFP/EBF3 for 24 h or 48 h. The cell proportion in S phase increased in HepG2 cells transfected with pEGFP/EBF3 in comparison with HepG2 cells transfected with pEGFPN1 or untransfected. These findings suggested that the transfection of EBF3 gene into HepG2 induced the cell proliferation from G1 phase to G2 phase by increasing the number of cells. CONCLUSION: The construction of pEGFP/EBF3 eukaryotic expression vector and the expression of EBF3EGFP fusion protein in HepG2 cells lay a foundation for further study of the relationship between EBF3 and its growth and the proliferation of tumor cells.

　　［Keywords］early Bcell factor 3; recombinant fusion protein; EGFP; HepG2 cell

　　［摘 要］ 目的: 构建早期B细胞因子3（EBF3）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3， 使EBF3EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。方法: 采用RTPCR技术， 从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因， 构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3， 用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2， 使EBF3EGFP融合蛋白得到表达。结果: 经转化细菌、 抽提质粒、 酶切鉴定和DNA序列分析证实， EBF3基因已正确插入pEGFPN1中EGFP基因的上游， 获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24 h后， 在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3EGFP融合蛋白主要表达于核内， 转染pEGFP/EBF3和pEGFPN1后48 h的转染效率分别为52%和59%。Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量（Mr）为87 000的EBF3EGFP融合蛋白， 转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h， S期细胞比例均明显高于pEGFPN1转染细胞组和未转染细胞组， 表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展， 从而促进细胞增殖。结论: 成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3， 并在HepG2细胞中进行了表达， 为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。

　　［关键词］早期B细胞因子3; 融合蛋白; 增强型绿色荧光蛋白; HepG2细胞

　　早期B细胞因子3（early Bcell factor 3 ， EBF3）是转录因子EBF家族成员之一， 1997年由Wang等［1］利用序列同源性筛选的方法在鼠胚胎cDNA文库中发现， 人EBF3由551个氨基酸残基组成， 相对分子质量（Mr）约为60 000， mRNA全长为4 361 bp， 基因定位于染色体10q26.3。Zardo等［2］研究发现EBF3 mRNA广泛表达于心脏、 胎盘、 肝脏、 骨骼肌等组织， 在大多数WHO组织病理学的分级标准中分级高的原发性脑肿瘤病例EBF3被复等位地甲基化和/或被删除， 与此一致的是EBF3表达于正常的人脑细胞系， 在脑肿瘤细胞系中沉默。Zhao等［3］研究提示EBF3可能是一个潜在的肿瘤抑制因子。原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一。为探讨EBF3在肝肿瘤细胞增殖调控中的作用， 我们采用RTPCR方法从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3基因的全长编码区序列， 构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与EBF3的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3， 转染人肝癌细胞株HepG2， 使EBF3EGFP融合蛋白得到表达， 并通过流式细胞术（FCM）分析转染细胞周期的变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 人肝癌细胞株（HepG2）由浙江大学医学院附属第一医院陈瑜惠赠。真核表达载体pEGFPN1由本室保存; 限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ、 dNTPs购自Promega公司; T4 DNA连接酶购自New England Bio公司; TRIzol试剂、 SuperScriptTMⅢ逆转录试剂盒、 质粒抽提纯化试剂盒、 LipofectamineTM 2000转染试剂购自Invitrogen公司; PhusionTM Hot Start高保真DNA聚合酶购自Finnzymes公司; 胶回收试剂盒购自上海华舜公司; DNA marker DL 2 000购自TaKaRa公司; RPMI1640培养液购自南京凯基公司; 胎牛血清购自Gibco公司; 倒置荧光显微镜购自Leica公司; 流式细胞仪购自BD FACSCalibur公司。细胞质与细胞核蛋白提取试剂盒、 cocktail酶抑制剂购自Pierce公司; Western blot化学发光ECL试剂购自北京普利莱公司; 电泳及电转移仪购自BioRad公司; 小鼠抗人EBF3单克隆抗体（mAb）购自Abnova公司; PVDF膜、 二喹啉甲酸（BCA）法蛋白浓度测定试剂盒、 小鼠抗人αTubulin mAb、 兔抗GFP抗体、 HRP标记山羊抗兔IgG二抗购自江苏碧云天生物技术研究所; 小鼠抗人Lamin B mAb购自Calbiochem公司; HRP标记羊抗小鼠IgG二抗购自Jackson公司; RNase A、 碘化丙啶购自南京生兴公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 构建真核表达载体pEGFP/EBF3 根据GenBank收录的人EBF3 mRNA（NM001005463）基因5′端序列并在ATG前加入Kozak序列（GCCACC）以提高翻译起始效率， 并在5′引入Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基， 设计前向引物为5′CCAAAAGCTTGCCACCATGTTTGGGATTCAGGAG3′。逆向引物设计时， 将人EBF3的终止密码子删除并使其阅读框与下游的EGFP基因一致， 在5′加入BamH Ⅰ酶切位点和保护碱基， 其序列为5′CGTCGGATCCCGCATTGGCGGGACTACCAGC3′。引物由上海生工公司合成。提取人胎盘组织总RNA， 紫外分光分析仪确定RNA纯度和浓度， 取总RNA 4 μg以随机六聚体为引物进行逆转录， 取cDNA 2 μL为模板， PCR扩增并胶回收目的产物， EBF3全长编码区PCR产物和pEGFPN1同时用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切， 胶回收酶切片段， 再用T4 DNA连接酶将二者在16℃连接16 h， 转化感受态大肠杆菌DH5α， 涂布于含30 mg/L卡那霉素的筛选LB培养基上， 经挑取克隆， 抽提质粒， 酶切鉴定， 阳性克隆进一步经测序鉴定。测序由上海捷瑞公司完成。

　　1.2.2 基因转染 细胞转染采用LipofectamineTM 2000试剂盒。含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液将HepG2置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养， 用RPMI1640培养液无血清饥饿培养HepG2细胞24 h， 使细胞周期基本同步在G1期， 换含100 mL/L FBS的RPMI1640培养液培养24 h， 细胞按1×108/L的细胞量接种12或6孔培养板， 培养24 h， 按试剂说明书步骤转染， 6 h后换含100 mL/L FBS无双抗的RPMI1640培养液继续培养24～72 h。收获6孔板细胞用于Western blot分析， 收获12孔板细胞用于细胞周期分析。

　　1.2.3 倒置荧光显微镜观察细胞EGFP表达并计算转染效率 将pEGFP/EBF3、 pEGFPN1转染后24 h、 48 h及未转染的HepG2细胞置倒置荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞， 并初步确定融合蛋白的亚细胞定位。胰酶消化， 粗略调整细胞密度为1×108～5×108/L之间， 血球计数板普通视野下计细胞数A， 换荧光下相同视野计荧光细胞数a， 计算转染效率（转染效率＝a/A×100%）。

　　1.2.4 Western blot确证EBF3EGFP融合蛋白的表达及细胞定位 胰酶消化转染pEGFP/EBF3、 pEGFPN1 24 h、 48 h及未转染的HepG2细胞， PBS洗涤2次后按细胞质与细胞核蛋白提取试剂盒说明书分别提取细胞质以及细胞核蛋白， BCA法测定蛋白浓度， 蛋白与5×上样缓冲液混合煮沸5 min后， 取20 μg核蛋白、 60 μg胞质蛋白上样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（SDSPAGE）凝胶电泳。电泳后电转移至PVDF膜， 用TBST缓冲液（20 mmol/L Tris HCl， 150 mmol/L NaCl和0.5 mL/L Tween 20）洗膜3次， 每次5 min， 用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液4℃封闭过夜。弃去封闭液， TBST洗膜3次， 每次5 min， 然后于4℃过液结合一抗。TBST洗膜5次， 每次5 min， 再加入HRP标记的相应二抗4℃孵育2 h， TBST洗膜3次， 每次5 min， 暗室中应用ECL发光液覆盖膜2 min， X光胶片曝光， 显影， 定影。PVDF膜浸没于蛋白印迹膜再生液Stripping buffer（62.5 mmol/L TrisHCl pH6.8， 100 mmol/L β巯基乙醇， 20 g/L SDS）， 摇床缓慢振摇再生20 min， TBST洗膜3次， 每次5 min， 再用封闭液封闭后可进一步检测其他抗原带。分别以αtubulin、 Lamin B作为细胞质蛋白、 核蛋白上样量校准品。

　　1.2.5 FCM分析转染细胞周期 胰酶消化转染pEGFP/EBF3、 pEGFPN1后24 h、 48 h、 72 h及未转染的HepG2细胞， PBS洗涤2次后用-20℃预冷的700 mL/L无水乙醇于-20℃固定过夜。离心除去固定液， PBS洗涤2次后加PI染液（柠檬酸三钠100 mg， Triton X100 300 μL， PI 10 mg， RNase A 2 mg， 加蒸馏水至100 mL， 4℃避光保存）400 μL， 混匀， 室温避光20 min， 300目尼龙膜过滤， FCM分析转染细胞周期的变化。实验重复3次， 取均值报告。

　　1.2.6 统计学分析 应用STATA7.0统计分析软件包进行统计处理， 实验结果以x±s表示， 采用双侧t检验分析， P&<0.05表明差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 pEGFP/EBF3融合基因表达载体的构建及鉴定 依据GenBank收录的人EBF3 mRNA（NM001005463）设计并合成ATG前带有Kozak序列的上游引物， 删除了终止密码子的下游引物， 以随机六聚体为引物对胎盘总RNA进行逆转录， PCR扩增cDNA， 扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定， 结果在约1 700 bp处有一特异性条带， 与目的基因相符， 胶回收目的产物， Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切回收产物和pEGFPN1， 连接， 转化DH5α， 挑取克隆， 抽提质粒， 酶切鉴定， 酶切产物分析见图1。阳性克隆进一步经测序鉴定， 结果显示288 nt处由a突变为c， 即密码子agg突变为cgg， 由于氨基酸编码的简并性， agg和cgg均编码精氨酸， 不影响融合蛋白的正确表达。重组质粒命名为pEGFP/EBF3， 其表达的融合蛋白命名为EBF3EGFP。

　　2.2 倒置荧光显微镜观察细胞EGFP表达并计算转染效率 利用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3、 pEGFPN1分别转入HepG2细胞后24 h， 倒置荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞并初步确定融合蛋白的亚细胞定位（图2）。空载体pEGFPN1转染的HepG2细胞中EGFP蛋白呈全细胞表达， 而pEGFP/EBF3转染的HepG2细胞中EBF3EGFP融合蛋白则主要表达于核内， 当细胞处于G1和M期时可清楚地观察到融合蛋白完全表达于核内。转染pEGFP/EBF3、 pEGFPN1后24 h， 转染效率分别为41%和45%， 48 h后， 转染效率分别为52%和59%， 但转染效率从转染48 h达到峰值后开始下降。

　　2.3 Western blot确证EBF3EGFP融合蛋白的表达及细胞定位结果 分别提取pEGFP/EBF3、 pEGFPN1转染后24 h、 48 h及未转染的HepG2的细胞质和细胞核蛋白。Western blot检测其中EGFP、 EBF3EGFP融合蛋白的表达（图3）。分别以αtubulin、 Lamin B作为细胞质蛋白、 核蛋白上样量校准品， 结果显示在细胞质蛋白中几乎检测不出核内参Lamin B条带， 在细胞核蛋白中细胞质蛋白内参αtubulin条带非常纤细浅淡， 说明细胞质蛋白和核蛋白相互污染较少。EBF3EGFP融合蛋白条带略小于预染蛋白质Mr标准90 000， 与预计结果（EBF3 60 000+GFP 27 000）87 000相符。转染pEGFP/EBF3后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出Mr 87 000的EBF3EGFP融合蛋白， 在细胞质中转染后48 h融合蛋白断裂或降解而出现Mr 27 000的GFP条带， 而在细胞核中该条带在转染后24 h就显现。在转染pEGFPN1和未转染细胞组细胞质和细胞核蛋白中均未检出Mr 87 000的融合蛋白条带， 在转染pEGFPN1后24 h和48 h细胞质和细胞核中均检出Mr 27 000的GFP条带。结果说明EBF3EGFP融合蛋白是在细胞质中合成后由EBF3核定位信号引导主动转运入核， 而GFP由于Mr&<40 000， 能自由通过核孔复合体而在胞质和细胞核中均可检出。

　　2.4 细胞周期检测结果 FCM分析细胞周期结果（表1）表明， 空载体pEGFPN1转染细胞的细胞周期与未转染对照组相比未发生明显改变， 而pEGFP/EBF3和pEGFPN1组相比， 在转染24 h后细胞各期比例基本相似， 在转染48 h和72 h后， 转染pEGFP/EBF3的细胞比转染pEGFPN1的细胞G1期细胞明显减少， S期明显增加， G2/M期变化不大。表明EBF3基因的导入改变了细胞周期， 促进了细胞增殖， 而且转染pEGFP/EBF3后G2/M比例未见增加， 说明转染pEGFP/EBF3后未引起细胞周期阻滞在G2/M期。 表1 转染后不同时间细胞周期变化

3 讨论

　　实验所选用的真核表达载体pEGFPN1中带有EGFP序列， 是比GFP荧光强度更强的一种GFP“红移”突变体， 其荧光蛋白的激发波长和发射波长分别为488 nm和507 nm， EGFP已成为蛋白质分子定位和细胞动力学研究中广泛应用的生物标志分子［4， 5］。克隆在pEGFPN1中的外源基因转染细胞后， 能通过观察荧光细胞而检测出细胞内基因表达及蛋白定位。

　　Zardo和Zhao等［2， 3］的研究结果提示EBF3可能是一个潜在的肿瘤抑制因子， Zhao还发现EBF3在75%（6/8）的肝癌细胞系中基因沉默。为了进一步探索EBF3在肝癌发生发展中的作用， 本研究中， 我们采用不表达EBF3的HepG2细胞作为研究用细胞株， 利用含CMV强启动子（PCMV IE）的pEGFPN1质粒， 在ATG前添加Kozak序列及删除了终止密码子的EBF3全部编码区PCR产物克隆至pEGFPN1， 在阳离子脂质体介导下， 将pEGFP/EBF3转染HepG2细胞， 并使EBF3EGFP融合蛋白获得表达。通过倒置荧光显微镜观察发现EBF3EGFP融合蛋白主要表达于细胞核内， 当细胞处于G1和M期时可清楚地观察到融合蛋白完全表达于核内。FCM分析细胞周期结果显示， 在转染pEGFP/EBF3后48 h和72 h， G1期细胞比例明显减少， S期明显增加， G2/M期变化不大， 表明EBF3基因的导入改变了细胞周期， 促进了细胞增殖， 并且转染pEGFP/EBF3后未引起细胞周期阻滞在G2/M期。研究结果与我们的前期研究发现肝癌组织中EBF3 mRNA及其蛋白表达均高于远端配对非癌肝组织结果相符（结果另文发表）， 与Zhao等［3］将重组腺病毒AdEBF3转染人骨肉瘤细胞株Saos2发现的EBF3的导入使细胞周期阻滞和发生凋亡结果不一致， 可能与EBF3对不同细胞株的作用存在差异有关。我们还推测EBF3是一个大Mr蛋白（60 000）， 与EGFP形成的融合蛋白彼此之间紧密相连， 在空间结构上可能存在相互作用， 影响了EBF3羧基端转录活性区转录活性的充分发挥， 如果在2个蛋白之间设计加上非极性甘氨酸短片段， 可能有助于消除二者在空间上的相互作用［6］。

　　总之， pEGFP/EBF3融合基因表达载体的构建及其在HepG2细胞中的有效表达， 为今后亚克隆至其他载体， 进一步研究EBF3对细胞生长增殖的影响、 探讨EBF3在肝癌及其他肿瘤发生中的作用， 寻找更好的预测指标和干预治疗靶点提供参考。

　　致谢: 诚挚感谢南通大学航海医学研究所吴小梅老师、 南通大学附属医院血液病研究室丁润生主任在实验过程中所给予的热心帮助。

参考文献

［1］ Wang SS， Tsai RY， Reed RR. The characterization of the Olf1/EBFlike HLH transcription factor family: implications in olfactory gene regulation and neuronal development［J］. J Neurosci， 1997， 17(11): 4149-4158.

［2］ Zardo G， Tiirikainen MI， Hong C， et al. Integrated genomic and epigenomic analyses pinpoint biallelic gene inactivation in tumors［J］. Nat Genet， 2002， 32(3): 453-458.

［3］ Zhao LY， Niu Y， Santiago A， et al. An EBF3mediated transcriptional program that induces cell cycle arrest and apoptosis［J］. Cancer Res， 2006， 66(19): 9445-9452.

［4］ Chen WY， John JA， Lin CH， et al. Expression pattern of metallothionein， MTF1 nuclear translocation， and its dnabinding activity in zebrafish (Danio rerio) induced by zinc and cadmium［J］. Environ Toxicol Chem， 2007， 26(1): 110-117.

［5］ Jiang P， Yamauchi K， Yang M， et al. Tumor cells genetically labeled with GFP in the nucleus and RFP in the cytoplasm for imaging cellular dynamics［J］. Cell Cycle， 2006， 5(11): 1198-1201.

［6］ 郄春花， 秦 波， 黄爱龙， 等. Hyper2IL26融合基因的构建及在真核细胞中的表达［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(2): 141-147.