哮喘豚鼠模型肺和骨髓中CCR3及CD34的表达及意义

　　　　 作者：陈德忠， 付国昊， 朱述阳， 吕丽丽 赵传云

【摘要】 目的: 观察哮喘豚鼠肺和骨髓组织CCR3及EOS不同时相表达的变化， 探讨哮喘发病的可能机制。方法: 用卵白蛋白(OVA)和生理盐水致敏法制备豚鼠哮喘和对照模型， 分为正常对照组（N）及哮喘组（A、 B、 C、 D、 E）， 每组8只， 于激发后30 min， 6 h， 12 h， 24 h， 48 h处死， 瑞氏染色计数骨髓涂片和外周血涂片中EOS比例， 免疫组织化学技术检测骨髓中CCR3及CD34蛋白的表达; 制备豚鼠肺组织病理标本， 苏木精伊红染色， 免疫组化检测肺组织中CCR3和CD34的表达。结果: (1)哮喘组骨髓和外周CCR3与CD34及EOS表达明显增加; (2)OVA激发后， 骨髓和外周CCR3、 CD34及EOS表达: 30 min变化不明显（肺内CD34表达增加）， 6 h（肺内CD34表达下降）、 12 h达到峰值， 24 h开始下降， 48 h恢复正常水平; (3)骨髓的变化早于外周， CCR3的表达高峰早于CD34表达与EOS的增多高峰， 且CCR3、 CD34和EOS互呈线性相关（肺组织内除外）。结论: 哮喘豚鼠肺组织和骨髓之间存在骨髓CD34＋祖细胞、 EOS细胞到循环再到肺组织的通路， 骨髓和肺组织CCR3表达增强， 为CD34＋细胞、 EOS从骨髓快速募集到肺组织提供了可能。

【关键词】 支气管哮喘; CCR3; CD34; 骨髓; 豚鼠

　　哮喘是多种细胞（如嗜酸粒细胞、 肥大细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞和气道上皮细胞等）和细胞组分参与的气道炎症性疾患， 哮喘气道炎症的特征性改变为嗜酸粒细胞（EOS）的浸润和活化。气道黏膜下的 EOS主要来源于骨髓CD34+干细胞在某些细胞因子(如eotaxin， IL5)的诱导下分化成熟为EOS， 释放入外周血， 在多种趋化信号的引导下向肺内定向募集。这一现象意味着从骨髓循环气道， 存在着调控EOS及其祖细胞定向迁移的信号通路。趋化因子eotaxin对EOS有高度的特异性， 其受体3(CCR3)在EOS膜上大量存在， 且与eotaxin 有高度亲和性， eotaxin是强有力的EOS趋化剂， eotaxin和CCR3 在哮喘发病机制中起重要作用。本实验我们探讨哮喘发作时骨髓和气道之间的调控EOS定向迁移信号通路; 通过研究CCR3及CD34的表达， 分析CCR3及CD34的改变对EOS在骨髓增殖分化及其在肺组织趋化和浸润的调节作用， 为临床开发治疗哮喘新方法提供理论依据。

1 材料和方法

　　1.1 材料 雄性豚鼠48只， 体质量(250±50)g， 由徐州医学院动物中心提供。随机分为对照组（N）、 哮喘组(根据处死时间分为A、 B、 C、 D、 E组)， 每组8只。鸡卵白蛋白(ovalbumin， OVA， 美国Sigma公司)、 CCR3、 CD34多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉Boster公司)、 奥林巴斯图像采集系统、 德国百瑞雾化器和自制雾化箱。

　　1.2 方法

　　1.2.1 哮喘模型的建立 哮喘组于第1天腹腔注射抗原混悬液1 mL (OVA 100 mg、 氢氧化铝200 mg)， 2周后将豚鼠放于自制雾化吸入箱内， 喷射雾化吸入10 g/L OVA 20 min， 连续5 d［1］。对照组于第1天腹腔注射1 mL生理盐水， 2周后喷射雾化吸入生理盐水20 min， 连续5 d。最后1次雾化吸入后， 哮喘组A、 B、 C、 D、 E分别于30 min， 6 h， 12 h， 24 h， 48 h处死动物， 对照组12 h处死， 取材并作相应测定。

　　1.2.2 骨髓和外周血EOS计数 于末次激发后， 断颈处死豚鼠， 取颈动脉血制作血涂片。取两侧股骨， 去掉两端骨骺， 剖开骨干髓腔， 以含肝素1667 μkat/L的生理盐水溶液将骨髓细胞冲洗出， 4℃， 1 000 r/min离心5 min后沉渣， 涂于多聚赖氨酸处理的玻片上， 干燥后以40 g/L多聚甲醛固定30 min， -20℃保存备用。骨髓和外周血涂片用瑞氏染色， 随机计数200个白细胞， 并计算其中EOS百分比。

　　1.2.3 骨髓细胞CCR3、 CD34表达的检测 采用SABC免疫组织化学法检测骨髓中CCR3、 CD34的表达。以兔抗大鼠CCR3 IgG为一抗， 以生物素化的羊抗兔IgG为二抗。取骨髓沉渣涂片， 按SABC免疫组化试剂盒说明书处理。在光镜下观察结果， 胞膜为棕黄色者为阳性细胞， 在光镜(×400)下随机选取5个视野， 计数阳性细胞数占白细胞总数的比例。

　　1.2.4 肺组织EOS计数及CCR3、 CD34表达的检测 无菌操作下切取部分肺组织， 40 g/L多聚甲醛固定， 常规石蜡包埋、 切片， 分别进行HE染色、 CCR3、 CD34免疫组化染色(严格按武汉Boster公司SABC试剂盒说明书操作) 。肺组织切片HE染色后， 每张切片计数200个细胞， 计算其中EOS百分比。免疫组化计数方法: 光镜下观察胞膜着棕黄色为阳性细胞。每例选择1张染色较好的切片， 显微镜下随机选取5个高倍视野(×400)， 计数， 取每视野的均数。

　　1.2.5 统计学分析 计量数据均采用x±s表示， 用 Stata7.0软件对数据进行t检验和相关分析， P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 哮喘豚鼠气道病理学改变 肺组织HE染色光镜下可见: 与对照组相比哮喘组大、 中、 小支气管收缩， 黏膜水肿， 平滑肌增厚， 上皮细胞肿胀， 部分上皮细胞变性、 坏死脱落， 杯状细胞增生， 支气管管腔狭窄甚至闭塞， 黏液栓形成; 支气管周围血管扩张、 充血， 黏膜、 黏膜下层及肺泡区有大量的炎症细胞浸润， 主要为EOS、 淋巴细胞、 单核细胞; 肺泡间隔增厚。激发后30 min上述改变不明显， 6 h， 12 h肺组织病变最明显， 24 h， 48 h逐渐恢复到正常肺组织表现(图1)。

　　2.2 外周血涂片、 骨髓细胞涂片及肺组织EOS计数 哮喘（豚鼠）激发后30 min， 与对照组相比变化不大， 且外周血EOS百分比稍有下降， 但无统计学意义; 6、 12 h升高明显(P&<0.01); 24 h开始下降(P&<0.05); 48 h基本恢复到正常水平。哮喘组不同时间点之间EOS也存在着变化: 6 h较30 min， EOS升高明显(P&<0.01); 12 h较6 h， 肺组织EOS变化不大(P&>0.05)， 骨髓和外周血升高(P&<0.05); 24 h较12 h， 48 h较24 h， EOS呈下降趋势(P&<0.01); 6、 12 h时EOS增多最明显， 与气道病理学改变相一致， 24 h开始下降， 48 h回到正常水平。 骨髓变化先于肺和外周血， 且持续时间短(图2)。

　　2.3 肺组织和骨髓中CCR3和CD34蛋白的表达 哮喘组肺组织和骨髓中CCR3和CD34蛋白阳性细胞呈棕黄色， 主要定位于细胞膜。肺组织中， 气道黏膜、 黏膜下层及血管周围、 肺泡区有大量呈棕黄色的阳性细胞， 气道黏膜上皮细胞、 血管内皮细胞及平滑肌细胞也有CCR3及CD34蛋白表达， 对照组在上述部位仅少量表达。骨髓细胞中， 呈棕黄色CCR3 蛋白阳性细胞大量表达于各阶段Eos细胞表面; 而CD34大量表达于未成熟的EOS祖细胞表面.不同时间点CD34的表达趋势和EOS的变化一致: 与正常组相比， 激发后30 min， 肺组织内表达升高（P&<0.05）， 骨髓内略有下降， 不明显（P&>0.05）; 6 h时， 肺内表达下降， 骨髓内开始升高（P&<0.01）; 12 h时， 肺组织和骨髓内CD34表达达到高峰（P&<0.01）; 24、 48 h逐渐下降， 恢复到正常水平。但是CCR3的表达则稍有不同: 与对照组相比骨髓及肺组织中CCR3 30min时开始升高（P&<0.05）; 6、 12 h达到高峰（P&<0.01）; 24 h开始下降（P&<0.05）; 48 h基本恢复到正常水平; 骨髓先升高， 肺组织随着变化， 但持续时间长于骨髓。表1 肺组织和骨髓中CCR3/CD34蛋白的表达

　　2.4 肺组织和骨髓EOS表达与CCR3蛋白表达的关系 EOS表达与CCR3蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织， r=0.93， P&<0.01; 骨髓， r=0.95， P&<0.01; 总， r=0.94， P&<0.01。EOS表达与CD34蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织， r=0.27， P&>0.05; 骨髓， r=0.71， P&<0.01; 总， r=0.38， P&<0.01。CCR3蛋白表达与CD34蛋白的表达存在着线性关系: 肺组织， r=0.28， P&>0.05; 骨髓， r=0.6291， P&<0.01; 总， r=0.37， P&<0.01。

　　3 讨论

　　CCR3主要由单一肽链组成的7 个螺旋跨膜结构， 属于G 蛋白藕联受体家族。CCR3 主要表达于EOS上， 介导其迁移及脱颗粒反应， ， 在嗜碱性粒细胞、 CD4+T细胞和树突细胞表面仅少量表达。Lamkhioued等［2］研究报道， CCR3固有表达于骨髓CD34+造血细胞表面。另有文献［3］报道， 支气管上皮细胞也表达CCR3， 而且与支气管上皮细胞表达的表皮生长因子受体存在交叉干扰。Shannon 等［4］研究发现eotaxin及eotaxin2通过与CCR3的结合可以诱导部分CCR3内陷和EOS的变形， 有助于EOS的活化和迁移。Joubert等［5］发现eotaxin 作用于气道平滑肌细胞CCR3可诱导平滑肌细胞迁移和增殖， 使细胞内Ca2+增高。Adachi 等［6］发现支气管上皮细胞表达CCR3可激活和诱导有丝分裂原激活蛋白（MAP）活化和细胞因子的产生。可见CCR3无论在气道炎症还是重塑方面都起到了重要作用。本实验发现哮喘时不但肺组织EOS浸润明显， CCR3表达增加， 而且黏膜上皮细胞， 平滑肌细胞上CCR3也有明显表达， 平滑肌增厚， 和既往研究一致。

　　以往研究表明， 在过敏性哮喘患者的骨髓中， 成熟和非成熟的EOS CCR3表达水平显著升高［7］。Lamkhioued等［2］研究证实， CCR3可表达于骨髓CD34+造血细胞表面， 在体内外eotaxin与CCR3结合后均表现出明显的趋化活性， 促使骨髓中CD34+细胞产生增多， 只有CCR3-骨髓干细胞转化为CCR3＋的细胞后， 才可以募集到肺。并且单独或与IL5协同作用可以使骨髓CD34+祖细胞定向分化为EOS， 并向外释放、 募集［8］， 分化过程中CD34＋转为CD34-成熟EOS。本实验发现: 一方面， 哮喘组骨髓CCR3及CD34表达明显高于对照组， 与EOS之间互呈线性相关（肺内除外）， 并且CCR3的表达高峰在6 h， 早于CD34+阳性细胞和EOS增加、 释放的高峰时间12 h， 说明在某些因子的作用下， 骨髓祖细胞表达CCR3， 进一步使CD34＋祖细胞、 EOS分化、 释放增多， 利于炎症的发展。另一方面， 哮喘激发后速发相炎症反应， 肺内CD34＋阳性细胞， EOS增加， 而骨髓内CD34＋阳性细胞减少， 血液内EOS减少， 随着时间发展， 迟发相炎症反应出现， 两者逐渐增加。考虑与早期炎症细胞的快速募集大于骨髓产生的速度有关。但是肺内CD34＋阳性细胞升高后有一下降过程， 后又升高， 考虑为快速募集后的原位造血， 使之消耗， 后来自骨髓的补给使其升高， 同时造成了肺内CCR3及CD34表达与EOS无明显的线性关系。证明在骨髓到外周血再到肺组织存在着密切的细胞信号环路联系。

　　近年研究的重点倾向于骨髓、 肺组织、 循环之间的细胞信号通路关系， 以便更好地为治疗哮喘开阔思路。如果能切断这方面的环路， 如通过抑制CCR3的表达， 或者给于其拮抗剂抑制CD34表面抗原的表达， 不但切断EOS迁移， 而且切断了CD34造血干细胞的分化、 迁移， 将对哮喘的治疗有很重要的意义。

参考文献

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