脂肪来源的干细胞移植对大鼠脑缺血后微血管生成及bFGF和VEGF表达的影响x

　　　　 作者：王杰华， 刘楠， 杜厚伟， 翁金森， 陈荣华， 肖迎春， 张逸仙

【摘要】 目的: 探讨脂肪来源的干细胞（ADSC）移植对大鼠脑缺血后微血管生成的可能机制。方法: 72只清洁级成年雄性SpragueDarley大鼠， 随机分为假手术组(Sham组)、 局灶性脑缺血组（MCAO组）、 溶剂对照组（vehicle组）和ADSC治疗组（ADSC组）， 每组18 只， 采用改良ZeaLonga线栓法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型， ADSC移植前用DAPI标记， ADSC 组于造模成功1 d后经侧脑室注射入30 μL的经DAPI标记的ADSC细胞悬液， 内含1×106细胞， vehicle组则注射同等剂量的PBS， 术后4 d、 7 d和14 d分批处死实验动物， 并断头取脑， 采用免疫组织化学法和半定量RTPCR法检测缺血区脑组织的新生血管及bFGF和VEGF表达的动态变化。结果: 大鼠脑缺血后缺血区即可见大量的微血管生成， 2周达高峰。ADSC组较MCAO组和vehicle组缺血区微血管密度明显增高（P&<0.01）; ADSC组术后4 d、 7 d和14 d脑组织中bFGF和VEGF的表达水平较MCAO组和vehicle组明显增高。结论: ADSC移植促进脑缺血大鼠缺血区微血管的生成， 其机制可能与促进bFGF和VEGF的表达有关

【关键词】 脂肪来源的干细胞; 脑梗塞; 血管生成; bFGF; VEGF

　　［Abstract］ AIM: To investigate the effects of adiposederived stem cell (ADSC) transplantation on the angiogenesis in the brain post focal cerebral ischemia in rats. METHODS: 72 male adult SpragueDawley rats were randomly pided into 4 groups: shamoperated group， middle cerebral artery occlusion (MCAO) group， vehicle group and MCAO+ADSCtreated group (n=18). A permenant focal cerebral ischemia model was established with the modified Longa's method. ADSC were labeled by DAPI before transplantation. One day after right MCAO， 30 μL of cell suspension containing 1×106 cells were injected into the lateral ventricle of MCAO+ADSCtreated group and the same dose of PBS was given to the vehicle group. On D4， D7 and D14 after MCAO， the rats were killed to detect the regeneration of microvessel and the expression of bFGF and VEGF in ischemic region by immunohistochemistry and RTPCR. RESULTS: A lot of microvessel proliferate in the injured cortex reached peak in 2 weeks. The microvessel density in the brain tissues of rats treated with ADSC was higher than that in MCAO group and vehicle group (P&<0.01). The expression of bFGF and VEGF in the brain tissues of MCAO+ADSCtreated group was higher than that in MCAO group and vehicle group on D4， D7 and D14 post MCAO. CONCLUSION: The transplantation of ADSC can promote the revascularization of cerebral ischemia in rats partly by enhancing bFGF and VEGF synthesis in brain.

　　［Keywords］adiposederived stem cell; cerebral ischemia; angiogenesis; bFGF; VEGF

　　［摘 要］ 目的: 探讨脂肪来源的干细胞（ADSC）移植对大鼠脑缺血后微血管生成的可能机制。方法: 72只清洁级成年雄性SpragueDarley大鼠， 随机分为假手术组(Sham组)、 局灶性脑缺血组（MCAO组）、 溶剂对照组（vehicle组）和ADSC治疗组（ADSC组）， 每组18 只， 采用改良ZeaLonga线栓法制作大脑中动脉栓塞（MCAO）模型， ADSC移植前用DAPI标记， ADSC 组于造模成功1 d后经侧脑室注射入30 μL的经DAPI标记的ADSC细胞悬液， 内含1×106细胞， vehicle组则注射同等剂量的PBS， 术后4 d、 7 d和14 d分批处死实验动物， 并断头取脑， 采用免疫组织化学法和半定量RTPCR法检测缺血区脑组织的新生血管及bFGF和VEGF表达的动态变化。结果: 大鼠脑缺血后缺血区即可见大量的微血管生成， 2周达高峰。ADSC组较MCAO组和vehicle组缺血区微血管密度明显增高（P&<0.01）; ADSC组术后4 d、 7 d和14 d脑组织中bFGF和VEGF的表达水平较MCAO组和vehicle组明显增高。结论: ADSC移植促进脑缺血大鼠缺血区微血管的生成， 其机制可能与促进bFGF和VEGF的表达有关。

　　［关键词］脂肪来源的干细胞; 脑梗塞; 血管生成; bFGF; VEGF

　　有研究证实， 脂肪来源的干细胞（adiposederived stem cell， ADSC）在体外可以向多种细胞系分化， 包括成骨细胞、 脂肪细胞、 肌细胞、 神经细胞及内皮细胞［1， 2］。将ADSC注射入脑缺血大鼠侧脑室， 发现可减轻神经功能的缺损［3］， 但具体作用机制有待进一步阐明。本研究中， 我们采用大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion， MCAO）脑缺血模型进行ADSC移植， 观察不同时间点微血管密度（microvessel density， MVD）并测定脑组织中碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表达， 以讨探ADSC移植的脑保护机制， 为ADSC治疗脑血管疾病提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 健康雄性SD大鼠72只， 质量250～280 g， 用于脑缺血模型制作; 雄性SD大鼠10只， 质量80～100 g， 用于细胞的分离培养实验， 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司（许可证号: SCXK沪20070003）。DMEM培养基、 2.5 g/L胰酶为Gibco公司产品， 胎牛血清( fetal bovine serum， FBS)购自海克隆公司， FITC标记的小鼠抗大鼠CD45、 小鼠抗大鼠CD90、 小鼠抗大鼠CD44抗体为AbD公司产品， FITC标记的小鼠抗大鼠CD34抗体为Santa Cruz公司产品， DAPI 为Sigma公司产品， CO2培养箱为Thermo公司产品， 倒置相差显微镜为Olympus公司产品， 兔抗大鼠bFGF、 兔抗大鼠VEGF抗体购自Santa Cruz公司， 兔抗人VIII因子多克隆抗体及即用型免疫组化EliVision plus试剂盒（鼠/兔）购自福州迈新生物技术开发有限公司。引物由上海生工生物工程技术公司合成， TRIzol购自Invitrogen公司， PCR试剂盒及逆转录试剂盒为MBI Fermentas公司产品， 凝胶成像分析系统为Syngene Genius公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞分离及扩增培养 取6～8周SD大鼠（80～100 g）， 用100 mL/L的水合氯醛0.2 mL麻醉后， 置于750 mL/L的乙醇中浸泡5 min， 无菌条件下取腹股沟处脂肪0.5 g; 用PBS仔细清洗， 用剪刀将脂肪组织剪成小块。37℃使用2 mL 0.75 g/L I型胶原酶消化45 min; 加入同体积DMEM液+100 mL/L FBS培养液中和消化液; 200目滤器过滤， 低速1 300 r/min离心15 min， 获得高密度的细胞沉淀物， 轻轻倾去上清液和漂浮的黄色组织， 将细胞振荡混匀; 再次离心去除上清后制成单细胞悬液接种于培养瓶中， 置于37℃、 50 mL/L CO2的培养箱内培养， 隔日换液， 以后每隔3 d换液1次。待细胞80%～90%融合时， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。取3或4代经鉴定之后的细胞用于移植实验。

　　1.2.2 流式细胞术鉴定 调整细胞密度1×109/L， 取100 μL 细胞悬液与FITC标记的小鼠抗大鼠CD45、 小鼠抗大鼠CD90、 小鼠抗大鼠CD44、 小鼠抗大鼠CD34抗体室温避光孵育30 min后， 上机检测。

　　1.2.3 DAPI标记ADSC 取长满瓶底的第3代细胞， 每瓶加入50 mg/L的DAPI置37℃孵育30 min， 用PBS漂洗3次以洗掉未结合的DAPI。离心收集细胞， PBS重悬， 置于冰浴中1 h内进行细胞移植。分别于4 d、 7 d、 14 d取部分脑组织用于冰冻切片， 厚度10μm， 荧光显微镜观察额顶皮质下脑组织（相当于缺血半暗带）。

　　1.2.4 实验动物分组及脑缺血动物模型的建立 大鼠随机分为假手术组(Sham组) ， MCAO组， 溶剂对照组（vehicle组）和MCAO +ADSC治疗组（ADSC组）。每组再分4 d、 7 d、 14 d三个亚组， 每组6只。参考改良Longa等［4］线栓法制备大鼠MCAO模型， 模型成功的分级标准参考Longa等［4］的方法。手术后神经功能评分为1～3分的大鼠入选本次研究。假手术组大鼠接受相似手术处理， 但是不插入线栓。ADSC治疗组于造模成功后24 h在脑立体定位仪下， 经侧脑室注射30 μL的细胞悬液， 内含1×106个细胞（所用细胞为3代或4代经鉴定之后的细胞）， 溶剂对照组于造模成功24 h后， 在脑立体定位仪下， 经侧脑室注射30 μL PBS为对照。术中大鼠用小加热毯保持肛温37℃。

　　1.2.5 微血管密度（MVD）检测 采用兔抗人VIII因子抗体（工作浓度约1∶100）及即用型免疫组化EliVision plus试剂盒（鼠/兔）， 进行免疫组织化学染色， AEC室温显色， 苏木素复染， 水性封片剂封片， 同时以PBS代替一抗作阴性对照。MVD计数按Weidner等［5］方法进行， 凡染成红褐色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个血管计数， 在400倍光学显微镜下， 每张切片在同一皮层缺血区选择10个视野进行微血管计数， 计算出每mm2面积内微血管的数量， 即微血管密度， 然后求其均值。

　　1.2.6 免疫组化染色 切片经脱腊至水， 30 mL/L h3O2室温孵育10 min， 高压修复2～5 min， 滴加正常山羊血清封闭液， 室温20　　min。甩去多余液体， 不洗。滴加适当稀释的一抗: 兔抗大鼠bFGF的一抗（工作浓度约为1∶200）和兔抗大鼠VEGF的一抗（工作浓度约1∶200）， 4℃过夜。每张切片滴加50 μL聚合物增强剂， 室温下孵育20 min。每张切片滴加50 μL酶标山羊抗鼠/兔IgG聚合物， 室温下孵育30 min。AEC室温显色， 显微镜下控制反应时间。自来水冲洗， 苏木素复染， 水性封片剂封片。对照试验用PBS 代替一抗。各步骤间用0.01 mol/L PBS（pH7.2）冲洗5 min， 冲洗3 次。阳性细胞计数: 在400倍光学显微镜下分别随机选取5个视野， 分别计数免疫反应阳性的细胞数。

　　1.2.7 RTPCR法检测bFGF和VEGF的表达 （1）总RNA 提取: 取大鼠脑组织(液氮冻存)100 mg 置于玻璃匀浆器中， 加入3 mL TRIzol 试剂， 严格按照说明书进行。分别取RNA 样品， 测定其260 nm和280 nm 的吸光度（A260和A280）， 并根据A260/A280比值评估RNA 的纯度 (正常范围: 1.8～2.0)， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。（2）逆转录反应: 总反应体系20 μL， 包括样品RNA 2 μg， DEPC水7 μL， Oligo dT 1 μL， RNA酶抑制剂1 μL， 10 mmol/L dNTPs 2 μL， 5×MMLV buffer 4 μL， MMLV RT 1 μL， 反应条件为: 70℃ 5 min， 42℃ 60 min， 70℃ 10 min， 终止反应。（3）PCR扩增: 在PCR仪中， bFGF、 VEGF反应条件为: 94℃ 5 min预变性后， 94℃ 30 s， 60℃ 30 s， 72℃ 30 s， 共32个循环后， 再于72℃延伸7 min。bFGF引物1序列: 5′ATCACTTCGCTTCCCGCACT3′; 引物2序列: 5′TCCAGGCGTTCAAAGAAGAAAC3′， 扩增片段长为304 bp。VEGF引物1序列: 5′CGGACCCTGGCTTACTGCT3′; 引物2序列: 5′TCTCCTATGTGCTGGCTTTGG3′， 扩增片段长为327 bp。以βactin为内参同时进行PCR反应， 反应条件为: 94℃ 5 min预变性后， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 共28个循环后， 再于72℃延伸7 min。βactin引物1序列: 5′ATTGTAACCAACTGGGACG3′; 引物2序列: 5′TCTCCAGGGAGGAAGAGG3′， 扩增产物490 bp。总反应体系为50 μL， 包括cDNA 3 μL， 1 mmol/L dNTPs 10 μL， 10×Taq聚合酶buffer 5 μL， 目的基因和βactin上下游引物各2 μL（10 pmol/L）， Mg2+ 3 μL， 去离子水24 μL， Taq酶1 μL。（4）电泳: 扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳， 应用凝胶成像分析系统半定量分析电泳条带的吸光度， 结果以目的基因与βactin吸光度的比值表示。

　　1.2.8 统计学分析 所有数据经过方差齐性检验和正态性检验， 实验数据用x±s表示， 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析， P&<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 细胞的扩增培养 原代培养贴壁筛选获得的细胞 3 d时数量较少， 散在分布， 细胞形态呈梭形， 呈典型的成纤维细胞样外观。随着原代细胞的迅速增殖， 细胞呈团簇集落样生长， 14 d左右细胞生长达80%～90%融合， 此时呈较均一的长梭形。原代培养过程中可见部分悬浮造血细胞， 经数次换液后其基本消失。传代细胞呈均匀分布， 生长迅速， 约3～4 d可铺满瓶壁， 细胞多呈梭形（图1）。

　　2.2 流式细胞术鉴定 所培养的第3代细胞高表达ADSC表面标志分子CD90及CD44， 都为100%， 而极低表达造血细胞表面分子: CD45和CD34， 分别为0.72%和1.54%（图2）。

　　2.3 DAPI标记的荧光观察 荧光显微镜下， 在额顶皮质下脑组织（相当于缺血半暗带）， 可观察到发蓝色荧光的DAPI阳性细胞， 呈弥散分布（图3）。

　　2.4 缺血区脑组织MVD分析 缺血后整个缺血区脑组织均可见大量的微血管生成。对缺血区皮层微血管计数结果显示， MCAO组和vehicle组缺血后微血管明显增生， 于缺血后2周达高峰， MCAO组和vehicle组之间在各个时间点MVD值均无统计学意义。ADSC组缺血后微血管明显增生且皮层缺血区可见很多散在的单个内皮细胞， 同样于缺血后2周微血管增生达高峰。各时间点ADSC组MVD值均显著高于MCAO组和vehicle组， 差异具有统计学意义（P&<0.01， 表1）。表1 各组不同时间段大鼠脑缺血区皮层脑组织MVD值(血管数/mm2)

　　2.5 大鼠梗死灶周围bFGF和VEGF的表达 bFGF和VEGF表达主要集中在梗死灶周围， 梗死灶中心仅见少量阳性表达。假手术组见少量bFGF和VEGF阳性细胞的表达。MCAO组和vehicle组于造模成功后4 d升高， 7 d后达到高峰， 14 d后下降， MCAO组和vehicle组之间在各个时间点表达均无统计学意义。ADSC组各个时间点（4 d、 7 d、 14 d）梗死灶周围脑组织bFGF和VEGF表达均明显高于MCAO组和vehicle组， 差异具有统计学意义（P&<0.01， 表2）。

　　2.6 大鼠梗死灶周围bFGF mRNA和VEGF mRNA的表达 假手术组bFGF mRNA和VEGF mRNA有微弱的表达， MCAO组和vehicle组于造模成功后4 d即达到高峰， 随后下降， MCAO组和vehicle组之间在各个时间点表达均无统计学意义。ADSC组bFGF mRNA和VEGF mRNA的表达在各个时间点（4 d、 7 d、 14 d）均明显高于MCAO组和vehicle组， 差异具有统计学意义（P&<0.01， 表3， 图4、 5）。 表2 大鼠梗死灶周围bFGF和VEGF阳性细胞数比较表3 大鼠梗死灶周围bFGF mRNA和VEGF mRNA表达

　　3 讨论

　　ADSC在一定诱导条件下可分化为神经样细胞， 并可促进脑缺血损伤神经功能的恢复已被动物实验所证实。Kang等［3］用诱导剂诱导LacZ腺病毒标记的ADSC注射入侧脑室， 发现可促进表达微管相关蛋白和胶质纤维酸性蛋白， 减轻神经功能的缺损， 但ADSC对缺血组织的保护作用尚未完全清楚。本实验结果表明， 脑缺血缺血区新生血管明显增多， ADSC移植组各时间点MVD值均明显高于MCAO组和vehicle组， 表明ADSC具有促进缺血区新生血管的形成和血液循环的再建立的作用， 而缺血区新生血管增生的范围与程度直接关系到缺血边缘区血流的改善。局部脑血液循环的改善， 有助于减少脑缺血半暗带的细胞凋亡、 促进脑缺血半暗带区受损而未死亡的神经元的修复， 促进轴突的出芽和新的突触联系的建立［6］， 并可为自身神经干细胞向缺血区迁移和分化， 植入的组织与细胞的存活和分化提供必要的微环境， 对损伤神经组织的保护、 修复及重建具有重要意义。

　　有研究显示， 在其他缺血损害模型中， ADSC移植可分泌多种营养因子和细胞因子， 包括VEGF、 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF）， 促进向血管内皮细胞的分化及提高缺血区VEGF表达进而促进缺血区血管生成［7， 8］。bFGF和VEGF在正常成人和动物组织中仅有微量的表达， 但在病理条件下如脑缺血时无论在mRNA水平还是在蛋白水平均有过量的表达。通过免疫组织化学法和RTPCR法， 本研究证实， ADSC移植可促进脑缺血区bFGF和VEGF的表达。VEGF作为对血管内皮细胞最具特异性的有丝分裂原［9］， 其可以作用于血管内皮细胞， 具有很强的促血管内皮细胞分裂、 增生、 迁移和增强血管通透性的作用。bFGF是一种促有丝分裂的小蛋白分子， 它可以促使微血管的生长分化， 使局部毛细血管数目增加。本实验结果表明缺血后4 d即可见bFGF mRNA和VEGF mRNA明显升高， 之后减弱， 而ADSC移植组各个时间点bFGF mRNA和VEGF mRNA的表达明显高于MCAO组和vehicle组。bFGF和VEGF蛋白的表达于缺血后即可见升高， 于7 d达高峰， 14 d略有下降， ADSC移植组各个时间点bFGF和VEGF蛋白的表达明显高于MCAO组和vehicle组。说明ADSC具有促进bFGF和VEGF表达的作用。同时本研究发现， ADSC移植后大鼠脑缺血区微血管生成数量与bFGF和VEGF的表达趋势一致， 表明缺血性脑损伤后脑组织新生血管形成可能与ADSC移植后促进脑组织中bFGF和VEGF的表达上调有关。

　　综上所述， ADSC移植能促进脑缺血区新生血管的生成及bFGF和VEGF的表达， 而bFGF和VEGF均有促血管生长、 保护内皮细胞的作用， 由此推测ADSC移植的脑保护作用部分是通过促进bFGF和VEGF的表达而发挥作用。但移植的ADSC在脑组织中是否能自身分化为血管内皮细胞， 是否能自分泌bFGF和VEGF， 有待进一步地探讨。

参考文献

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